Método de análisis genético por detección simultánea de marcadores microsatélites en una única reacción PCR para el análisis del parentesco en la especie Solea Senegalensis.

La presente invención se refiere a un método de análisis del parentesco en poblaciones de Solea Senegalensis, basado en la amplificación de un grupo de microsatélites aportados por la invención. Estos marcadores moleculares son altamente informativos, puesto que tienen un elevado número de alelos, no se encuentran ligados y dos de ellos se localizan en regiones codificantes (poco variables). Además, son susceptibles de ser amplificados en una única reacción de PCR, a partir de una serie de cebadores que también describe la invención

Método de análisis genético por detección simultánea de marcadores microsatélites en una única reacción PCR para el análisis del parentesco en la especie Solea senegalensis.

La presente invención se refiere un método de análisis del parentesco en poblaciones de Solea senegalensis, basado en la amplificación de un grupo de microsatélites aportados por la invención. Estos marcadores moleculares son altamente informativos, puesto que tienen un elevado número de alelos, no se encuentran ligados y dos de ellos se localizan en regiones codificantes (poco variables). Además, son susceptibles de ser amplificados en una única reacción de PCR, a partir de una serie de cebadores que también describe la invención.

Estado de la técnica anterior

El lenguado, Solea senegalensis es una especie de pez plano naturalmente distribuido en el mar Mediterráneo y en las áreas atlánticas de África. Esta especie tiene un elevado valor comercial y es considerada de gran potencial para la acuicultura, aunque aun se encuentra en estadios tempranos de domesticación. Existe por tanto, una creciente necesidad de desarrollar herramientas moleculares (Porta J.; et al. (2006) Aquaculture 251, 46-55.), que permitan llevar a cabo análisis genéticos de los individuos y las poblaciones de S. senegalensis.

El análisis genético de las poblaciones en cultivo es muy útil en la asignación de la paternidad, con el objeto de seleccionar individuos reproductivos para los criaderos, evitando de esta manera los efectos de tipo fundador o de cuello de botella, y también para valorar los cambios genéticos que ocurren en estos cultivos estableciendo el grado de degeneración genética en las poblaciones. En este sentido, los microsatélites, repeticiones variables en tamden de unos pocos pares de bases, son una herramienta ampliamente utilizada en los estudios de parentesco o de paternidad y en los análisis comparativos en poblaciones, ya que posibilitan la asignación de individuos a grupos de familias e incluso la estimación de la relación entre individuos, para así poder seguir la evolución de la descendencia.

Hasta el momento, únicamente unos pocos microsatélites han sido descritos para la elaboración de los estudios genéticos poblaciones de S. senegalensis (Porta J. et al. (2004). Molecular Ecology Notes 4, 277-279; Fuentes, V. Et al. (2004). Molecular Ecology Notes 4, 339-341). Sin embargo, la necesidad de realizar varias reacciones de amplificación para el análisis de los microsatélites y su localización en regiones no codificantes del genoma los hacen deficientes para su utilización en análisis de parentesco en poblaciones amplias.

En la actualidad se conocen al menos dos análisis de paternidad o del parentesco para S. senegalensis (Castro, J. et al. (2006). Aquaculture 261, 1194-1203; Porta J. et al. (2006b). Aquaculture 256, 159-166), los cuales ofrecen una información limitada acerca de las poblaciones y necesitan llevar a cabo al menos dos reacciones de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) para analizar un grupo 4 y 5 microsatélites. Además, todos los microsatélites empleados en estos tests proceden de regiones no codificantes del genoma del S. senegalensis, de modo que la información que aportan es más limitada que si su origen estuviese en una región codificante.

Descripción de la invención

Los autores de la presente invención han desarrollado un método el análisis de la paternidad o del parentesco en individuos y poblaciones de S. senegalensis, basado en el análisis de un grupo de microsatélites aportado por la invención. Además, este grupo de microsatélites presenta la ventaja de ser susceptible de amplificación en una única reacción de PCR (PCR múltiple), e incluso ser detectado empleado cebadores marcados con sólo tres cromóforos.

A partir de cuatro genotecas propias de S. senegalensis se seleccionaron 55 microsatélites, los cuales mostraron una amplificación eficiente y un elevado nivel de polimorfismo, y a partir de genotecas de cDNA se caracterizaron otros 20. De los 75 microsatélites iniciales se tomaron finalmente 8, 6 procedentes de la primera genoteca (Mss1, Mss3, Mss11, Mss14, Mss28, Mss44) y 2 (Sse2H15, Sse3H07) de la segunda. Estos microsatélites mostraron diferentes motivos de repetición (Tabla 2), y su selección se basó en dos condiciones fundamentales: (i) la similitud en las condiciones de amplificación por PCR y (ii) el tamaño de los fragmentos amplificados para cada microsatélite. Estos marcadores han permitido el desarrollo una potente herramienta para el análisis del parentesco en la especie S. senegalensis, que además puede ser llevada a cabo en una única reacción en cadena de la polimerasa.

La aplicación del método que aporta la invención se extiende a varios campos muy diversos como son los estudios en genética de poblaciones, utilización en programas de mejora genética, expresión génica, caracterización de loci con interés cuantitativo (QTLs) y estudios filogenéticos y de evolución (Takezaki, N. y Nei, M. (1996). Genetics 144, 389-399).

En el campo de la acuicultura el empleo de este tipo de análisis es de gran utilidad para el establecimiento inicial de los cardúmenes de reproductores, puesto que el uso de una única población como fuente para el cultivo de una determinada especie, causa una reducción en la diversidad intraespecífica debido a la consanguinidad (lo cual conlleva a muchos problemas de viabilidad) y/o propagación de genotipos alóctonos (con las consecuencias negativas que ello implica para los genotipos autóctonos). De este modo, el análisis de la variabilidad genética de los cardúmenes cultivados (estudio de la heterozigosidad), con estos microsatélites, permite detectar la presencia o no de depresión por consanguinidad en un cultivo con el objeto de controlarlo y evitar situaciones de riesgo.

Estos análisis también posibilitan la comprobación de la relación de parentesco entre los individuos usados como reproductores o poner de manifiesto en un stock qué individuos son los que están realizando las puestas, para así actuar en la selección y distribución de los ejemplares reproductores más adecuados.

Por otro lado, existen expectativas referidas a la posibilidad de encontrar alelos de microsatélites que estén relacionados con caracteres de interés comercial y poder así ser utilizados en la selección de genotipos de interés. En este mismo sentido, es posible descartar genotipos no deseados impidiendo así su propagación.

Por último, comentar que la información sobre la diversidad genética de las poblaciones usando estos microsatélites puede utilizarse, bien en poblaciones naturales para la aplicación de mejores estrategias de gestión de los cardúmenes de los individuos salvajes S. senegalensis, bien en poblaciones cultivadas y que quieran ser utilizadas para programas de repoblación del medio natural.

Así, un primer aspecto de la presente invención se relaciona con un método de análisis del parentesco en la especie S. senegalensis, en adelante método de la invención, que comprende:

El paso b) puede ser llevado a cabo mediante metodologías sobradamente conocidas en el estado de la técnica, entre las que se pueden incluir sin ningún tipo de limitación electroforesis de poliacrilamida y detectar los resultados mediante cebadores marcados con radioactividad, mediante tinción con plata del gel, sondas, etc. En estos últimos métodos, las reacciones de PCR o PCR múltiple y electroforesis no podrían llevarse a cabo conjuntamente para todos los microsatélites, teniendo que realizarse en grupos de dos o de tres. Así, en una realización preferida de la invención, la detección es llevada a cabo a través del marcaje de los cebadores, preferentemente con al menos tres cromóforos,...

1. Método de análisis del parentesco en la especie S. senegalensis que comprende:

2. Método de análisis del parentesco, según la reivindicación anterior, donde los cebadores específicos están marcados con al menos 3 cromóforos.

3. Método de análisis del parentesco, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde los cebadores específicos se seleccionan del grupo que consiste en las secuencias SEQ ID N° 9-24 o sus secuencias complementarias.

4. Kit para llevar a cabo el método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que comprende cebadores específicos de llevar a cabo la amplificación simultanea de los 8 microsatélites que se encuentran comprendidos en las secuencias SEQ ID N° 1-8.