Procedimiento para la determinación de la fragmentación del ADN en microorganismos.

La presente invención se relaciona con un procedimiento para la determinación de la integridad del ADN en microorganismos, y un kit para la evaluación de la integridad del ADN en los mismos.

Debido a que la muerte celular se traduce en fragmentación del ADN, con el presente procedimiento se puede discriminar claramente, y de forma sencilla, rápida y precisa, los niveles de fragmentación de ADN en microorganismos

Procedimiento para la determinación de la fragmentación del ADN en microorganismos.

La presente invención se encuadra dentro del campo de la industria biotecnológica, y principalmente aquel relacionado con la microbiología, cuyo ámbito de aplicación se encuentra dentro del sector sanitario (humano, veterinario, medioambiental, y básico).

En concreto, re refiere a un procedimiento para la determinación de la integridad del ADN en microorganismos, dado que la muerte celular se traduce en fragmentación del ADN y un kit para la evaluación de la integridad del ADN en microorganismos.

Estado de la técnica

Los microbios pueden morir por diversas causas. En el caso de las bacterias, organismos de especial interés sanitario, el mecanismo final de muerte por acción de agentes antibióticos es prácticamente desconocido, seguramente por lo obvio del problema. Los antibióticos afectan procesos celulares importantes, que tarde o temprano llevarán a la muerte de la célula. A pesar del conocimiento del mecanismo inicial de acción de un antibiótico concreto, a veces no es posible discernir claramente un efecto bacteriostático o bactericida. Este cuadro acerca de la muerte celular es especialmente complicado por la reciente descripción de la presencia de una pequeña proporción de células que persisten invulnerables a los antibióticos bactericidas, a pesar de no ser mutantes y no crecer en presencia del antibiótico. Dichas células persistentes parecen explicar la alta resistencia de los biofilms y de los cultivos estacionarios a la muerte por agentes quimioterápicos.

Por otra parte, los estudios de perfil de transcripción de la totalidad de los genes de Escherichia coli, han demostrado la existencia de un grupo de genes que se inducen y otros que se reprimen de forma común tras la acción de antibióticos, siendo el mecanismo de acción muy diferente. Esto se comprobó con la ampicilina, inhibidora de la síntesis de la pared celular, y con la ofloxacina, fluoroquinolona que bloquea la ADN girasa y la topoisomerasa IV, induciendo daño directo en el ADN (Kaldalu N, Mei R, Lewis K Killing by ampicillin and ofloxacin induces overlapping changes in Escherichia coli transcription profile. Antimicrob Agents Chemother 2004; 48:890-896.)

Estos conocimientos sugieren que la muerte celular en bacterias, por ejemplo tras la acción de un antibiótico bactericida, podría ser un proceso programado, al igual que el fenómeno de apoptosis, presente en los organismos superiores. Un fenómeno similar ha sido descrito en levaduras unicelulares, como respuesta la acción de agentes fungicidas. La autolisis de las células bacterianas por autodigestión de la pared celular por autolisinas, tras la exposición a antibióticos o condiciones ambientales adversas, puede ser una expresión de la muerte celular programada de organismos defectuosos (Lewis K Programmed Death in Bacteria. Microbiol Mol Biol Rev 2000; 64: 503-514.)

La mayor parte de estudios de acción quimioterápica se vienen evaluando de modo rutinario, desde los inicios de la microbiología, valorando el crecimiento celular como, la capacidad de producir colonias en un medio de cultivo semisólido, o de producir turbidez en un medio líquido. Este sistema además de ser relativamente largo, no evalúa el comportamiento de cada célula, sino el conjunto en general, y sólo es aplicable a aquellos microorganismos con capacidad de ser cultivables in vitro. Para estudiar el estado vital de cada célula, es necesario el uso de técnicas de microscopía o citometría. (Lecoeur H Nuclear apoptosis detection by flow cytometry: influence of endogenous nucleases. Exp Cell Res 2002; 277:1-14; Steensma DP, Timm M, Witzig TE. Flow cytometric methods for detection and quantification of apoptosis. Methods Mol Med 2003; 85:323-332).

Una posible evaluación, aunque no habitual, es valorar la permeabilidad de la pared celular y de la membrana celular, usando colorantes vitales. La célula sólo se tiñe con el colorante vital si posee una alteración de la barrera que la aísla del exterior, lo cual suele estar ligado a la lisis por choque osmótico. Sea por daño directo, a través de sistemas enzimáticos, o a través de la pérdida de la integridad de la membrana, el ADN del cromosoma del microorganismo debe fragmentarse en el proceso de muerte celular. Sin embargo, la integridad del ADN cromosómico no se ha venido evaluando como parámetro de muerte microbiana, en estudios in situ, célula a célula. Esto se debe a la ausencia de una técnica asequible, fiable y reproducible, para determinar la integridad de un ADN cromosómico de pequeño tamaño en relación con el de las células de organismos superiores.

Existen diferentes metodologías in situ, bien establecidas, para evaluar la integridad del ADN de las células de organismos superiores, en relación con el daño inducido, y con la muerte celular por apoptosis o necrosis. Entre ellas se destacan el etiquetado de roturas del ADN in situ introduciendo nucleótidos marcados en las mismas utilizando enzimas como la transferasa terminal (TUNEL) o la ADN polimerasa (in situ nick translation ISNT) (Didenko V, ed. In situ detection of DNA damage. Humana Press, Totowa, New Yersey, 2002.)

Estas metodologías se basan en el empleo de enzimas sobre las células fijadas en portaobjetos, las cuales actúan sobre extremos 3'-OH de las roturas, es decir, sin modificaciones químicas. Por dicho motivo su eficacia es irregular, resultando sólo marcadas aquellas roturas accesibles a la enzima, lo cual se traduce en una reproducibilidad relativamente baja de los resultados. Existe un único trabajo de aplicación de la técnica de TUNEL para la detección de roturas del ADN bacteriano, en Escherichia coli y la arquea Haloferax volcanii (Rohwer F and Azam F. Detection of DNA Damage in Prokaryotes by Terminal Deoxyribonucleotide Transferase-Mediated dUTP Nick End Labeling Appl Environ Microbiol 2000; 66:1001-1006.)

En este estudio se demostró la capacidad de detección de la fragmentación del ADN bacteriano tras infección por un fago. Sin embargo, las roturas originadas directamente por el peróxido de hidrógeno, en ciertas condiciones, no eran detectadas. Esto puede deberse a la imposibilidad de la enzima de marcar roturas con extremo 3'-OH modificados, lo cual es una dificultad de esta técnica. Por otra parte, las células deben ser fijadas para efectuar estas técnicas, lo cual afecta a la capacidad de marcaje. Además, los reactivos son caros, por lo que estas técnicas sólo se aplican en estudios de investigación, no siendo posible utilizarlas para la valoración rutinaria del daño del ADN y su degradación. Estas técnicas son relativamente largas y complejas, por lo que no se han establecido de modo habitual en microbiología, no habiéndose descrito más trabajos en relación a las mismas.

Otra técnica de microscopía para el estudio in situ, célula a célula, de la integridad del ADN, es el ensayo de cometas, o electroforesis de célula única (Olive PL, Durand RE. Heterogeneity in DNA damage using the comet assay. Cytometry 2005; 66:1-8.)

Las células eucariotas se incluyen en un microgel de agarosa sobre un portaobjetos y se someten a soluciones lisantes para extraer las membranas y las proteínas. Se obtienen así nucleoides, es decir, núcleos desproteinizados, en los que los bucles de ADN se han relajado por la descompactación. Los nucleoides se someten a una electroforesis en una cubeta rellena de solución tampón, de tal modo que las fibras de ADN migran hacia el ánodo, constituyendo una imagen de corneta, con una cabeza y una cola en la dirección de la migración electroforética. Estos cometas se tiñen con un colorante fluorescente, para ser observados mediante microscopía de fluorescencia. Si el núcleo presenta fragmentación del ADN, gran cantidad de fragmentos del mismo habrán migrado, concentrándose en la cola del corneta. Se trata de un test bastante sensible, pero relativamente caro y complicado para un laboratorio clínico convencional. De hecho, requiere cierto instrumental no común: fuente y cubeta de electroforesis y un sistema de captación de las imágenes y de análisis de las mismas. Por todo ello, sólo se utiliza con fines de investigación. Existe un único trabajo publicado de aplicación de la técnica de cometas a pH neutro, en la bacteria Escherichia coli (Singh NP, Stephens RE, Singh H, Lai H. Visual quantification of DNA double-strand breaks in bacteria. Mutat Res 1999; 429:159-168.)

La técnica es larga y engorrosa, requiriendo...

1. Un procedimiento para evaluar la integridad del ADN de los microorganismos que comprende las etapas de:

2. Un procedimiento de acuerdo a la reivindicación 1, en el que la etapa a) es opcional.

3. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en el que la solución de lisis comprende un detergente fónico desnaturalizante de proteínas.

4. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el detergente iónico es un detergente seleccionado del grupo del dodecilsulfato de sodio (SDS), sulfonato de alquilbenceno, laurilsarcosina (sarkosil), sal hidratada del ácido glicocólico, y sus mezclas.

5. Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que el detergente iónico es preferentemente el dodecilsulfato de sodio (SDS).

6. Un procedimiento cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la solución de lisis comprende ditiotreitol (DTT) entre 0.001 y 2M; 2-amino-2 (hidroximetil)-1,3-propanediol (Tris) entre 0.001 y 2M; ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) entre 0.001 y 2M, y dodecilsulfato de sodio (SDS) entre 0.1 y 3%.

7. Un procedimiento según la reivindicación 6, en el que la solución de lisis se ajusta a pH entre 6,5 y 10,5.

8. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 6 y 7, en el que la solución de lisis comprende preferentemente ditiotreitol (DTT) 0.1 M; (hidroximetil)-1,3-propanediol (Tris) 0.01M; ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) 0.05M, y dodecilsulfato de sodio (SDS) 2%.

9. Un procedimiento según la reivindicación 8, en el que la solución de lisis se ajusta a pH alrededor de 10, con NaOH.

10. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la tinción de la etapa d) se realiza con una solución de fluorocromo.

11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la muestra que contiene los microorganismos, se incluye en un microgel inerte.

12. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que la muestra que contiene los microorganismos, se incluye preferentemente en un microgel de agarosa.

13. Procedimiento de evaluación de la integridad del ADN de los microorganismos según la reivindicación 1, en el que la estabilización y adherencia del ADN del microorganismo se realiza de modo rápido, mediante calor seco, incubando el portaobjetos con la muestra lisada, en un horno microondas.

14. Procedimiento de evaluación de la integridad del ADN de los microorganismos según la reivindicación 1, en el que la evaluación se realiza mediante análisis visual directo.

15. Procedimiento de evaluación de la integridad del ADN de los microorganismos según la reivindicación 1, en el que la evaluación se realiza de forma automatizada mediante la aplicación de software de análisis de imágenes digitalizadas, obtenidas mediante cámaras acopladas a plataformas de microscopia.

16. Un Kit para la evaluación de la integridad del ADN de los microorganismos que comprende:

17. Un Kit de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la solución de lisis comprende ditiotreitol (DTT) entre 0.001 y 2M; 2-amino-2(hidro)imetil)-1,3-propanediol (Tris) entre 0.001 y 2M; ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) entre 0.001 y 2M, y dodecilsulfato de sodio (SDS) entre 0.1 y 3%.

18. Un Kit de acuerdo con cualquiera de las la reivindicaciones 16 y 17, en el que la solución de lisis se ajusta a pH entre 6,5 y 10,5.

19. Un Kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en el que la solución de lisis comprende preferente ditiotreitol (DTT) 0.1M; (hidroximetil)-1,3-propanediol (Tris) 0.01M; ácido etilendiamino tetraacético (EDTA) 0.05M, y dodecilsulfato de sodio (SDS) 2%.

20. Un Kit de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, en el que la solución de lisis se ajusta a pH alrededor de 10, con NaOH.