COMPOSICION PARA AUMENTAR LA PERMEABILIDAD DE LAS PAREDES DE MICROORGANISMOS Y METODO PARA DETECTAR DICHOS MICROORGANISMOS EN UNA MEMBRANA.

Composición para permeabilizar paredes de microorganismos, que comprende entre 5 y 95% en peso de etanol y entre 100 y 900 µg/ml de polietilenimina (PEI)

Composición para aumentar la permeabilidad de las paredes de microorganismos y método para detectar dichos microorganismos en una membrana.

La presente invención se refiere a una nueva composición para permeabilizar paredes de microorganismos y a los usos de aquélla y, en particular, al uso de aquélla en un método para el recuento y/o identificación programada de los microorganismos en un medio líquido o gaseoso.

La invención se aplica al control de la calidad microbiológica de los medios líquidos y gaseosos implicados en líneas de producción de productos alimenticios o farmacéuticos.

En este campo, frecuentemente los microorganismos a detectar están presentes en un número muy pequeño y es aconsejable diferenciar la naturaleza de los microbios para determinar si presentan un riesgo para la salud humana. El control realizado debe avisar, en un período de tiempo corto, de cualquier contaminación del producto fabricado posibilitando, cuando fuera apropiado, detener su fabricación y realizar etapas de descontaminación.

Se han desarrollado muchos métodos para minimizar el tiempo de cultivo de microorganismos y posibilitar al mismo tiempo investigar ciertos microbios.

Este es el objeto en particular del método para detectar microorganismos realizado después de filtrar el líquido a través de una membrana y descrito en la solicitud WO 01/59157. De acuerdo con este método, los microorganismos contenidos en una muestra líquida se retienen en la superficie de una membrana al pasar el líquido a través de la citada membrana. Los microorganismos se cultivan en la superficie de la membrana en contacto con agar como medio de cultivo durante el tiempo necesario para formar una microcolonia no visible a simple vista. Las células que forman la microcolonia se lisan después para liberar su contenido de adenosina trifosfato (ATP) y ácido nucleico. El ATP se usa como marcador para identificar y cuantificar las células vivas por bioluminiscencia producida por la oxidación enzimática del ATP (abreviadamente bioluminiscencia-ATP). La detección se califica como universal porque el ATP es un marcador que está presente en todos los microorganismos vivos. La lectura del resultado se obtiene por medio de una reacción de quimioluminiscencia que implica la conversión del ATP en fotones por una enzima específica del citado ATP. La señal luminosa se detecta usando una videointerfaz apropiada (por ejemplo, una cámara LCD). La imagen obtenida posibilita visualizar in situ el lugar de la membrana donde se ha desarrollado el microbio, de una manera similar al recuento convencional realizado en una placa de Petri con agar.

El sistema Milliflex Rapid®, comercializado por la compañía Millipore, funciona basándose en el principio antes descrito. Este sistema se diseñó para realizar las etapas de filtración y detección al mismo tiempo y en la misma membrana, que está montada en un soporte de plástico. Este soporte se diseña para ajustarse a los diversos dispositivos que se usan para la filtración, cultivo de los microorganismos, impregnación de la membrana con reactivos de detección y toma de imágenes con una cámara de vídeo.

Este sistema miniaturizado permite un ahorro apreciable de tiempo en comparación con los ensayos convencionales en placas de Petri. Además, posibilita almacenar en un soporte digital las imágenes obtenidas, lo cual posibilita seguir las contaminaciones (aptitud de detectar cantidades traza).

Sin embargo, este sistema tiene ciertas limitaciones debido al hecho de que, en la práctica, el recuento de los microorganismos presentes en la superficie de la membrana se realiza después de la lisis de las células. En consecuencia, es difícil reutilizar la misma membrana con vistas a identificar con exactitud los microorganismos detectados.

Sin embargo, para demostrar la presencia de ciertos microorganismos es posible realizar una hibridación específica usando sondas marcadas, ya sean de nucleótidos o del tipo de PNA (péptido-ácido nucleico).

Las sondas de PNA tienen la ventaja de ser de naturaleza peptídica, lo cual posibilita en ciertas aplicaciones sustituir ventajosamente a sondas de oligonucleótidos.

En general, la hibridación in situ con sondas requiere accesibilidad completa a los ácidos nucleicos de la célula; de lo contrario esta manipulación genera negativos falsos.

La solicitud WO 2004/050902 describe un sistema de detección en una membrana que posibilita detectar la presencia de microorganismos que contaminan muestras de sangre.

La particularidad de este sistema reside en el hecho de que los microorganismos se detectan por la penetración de agentes marcadores en los microorganismos a través de su pared. Los agentes marcadores usados son moléculas pequeñas, en particular compuestos que intercalan ácidos nucleicos (DNA, RNA), como derivados de cianina, yoduro de propidio, naranja de acridina o bromuro de etidio, y que tienen menos dificultad de penetrar en los microorganismos que sondas de oligonucleótidos.

La muestra líquida a ensayar se diluye en una solución de permeabilización que comprende el agente marcador y un reactivo de permeabilización de las células. Las células se incuban en esta solución de permeabilización, cuya finalidad es incrementar la porosidad de la pared de las células y facilitar así la penetración del producto marcador en los microorganismos presentes. Posteriormente la solución de permeabilización se filtra, con los posibles microorganismos que contiene, a través de una membrana. Los microorganismos presentes quedan retenidos sobre la membrana y después se detectan por reacción del agente marcador con un compuesto y/o un foco de luz que permite la emisión de una señal fluorescente. Este sistema tiene la ventaja de no lisar los microorganismos o, por lo menos, limitar lo máximo posible su destrucción antes de su detección.

Esto origina una detección que ofrece mejor resolución.

Sin embargo, como los marcadores no son específicos, este sistema no posibilita determinar la naturaleza de los microorganismos detectados.

Además, en dicho sistema, la manipulación de los microorganismos tiene lugar en solución, lo cual requiere precauciones específicas y equipo más complejo. Se debe indicar que la incubación de las células vivas en solución antes de la filtración tiene el inconveniente de que las células pueden continuar desarrollándose y dividiéndose antes de ser fijadas sobre la membrana, lo cual genera dudas sobre el resultado final del ensayo.

También es difícil dosificar adecuadamente el reactivo de penetración en la solución de permeabilización de acuerdo con el método descrito en la solicitud WO 2004/050902, en particular cuando se busca detectar simultáneamente bacterias gram-positivas, que generalmente son más sensibles a agentes permeabilizantes, y bacterias gram-negativas más resistentes.

Los agentes de permeabilización que pueden constituir la composición de la solución de permeabilización son típicamente ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), polietilenglicol (PEG), digitonina, nonensina, hexametafosfato sódico o cloruro de benzalconio.

También es posible usar polietilenimina (PEI), que es un polímero alifático policatiónico y ligeramente básico, conocido por hacer a las paredes bacterianas permeables a solutos, como antibióticos, que normalmente no penetran en el citoplasma de las bacterias [I. M. Helander et al., Polyethyleneimine is an effective permeabilizer of gram-negative bacteria, Microbiology (1997), 143: 3.193-3.199].

La concentración de polietilenimina en las soluciones de permeabilización como las descritas en la solicitud WO 2004/050902 está limitada a concentraciones generalmente inferiores a 100 µg/ml. La concentración más adecuada para bacterias gram-negativas, como Escherichia coli, es aproximadamente 20-30 µg/ml.

El objetivo de la presente invención es encontrar respuesta a las limitaciones de los sistemas existentes antes mencionados de detección de membranas.

Sorprendentemente, los presentes inventores han observado que el uso de polietilenimina (PEI) combinada con por lo menos un alcohol, particularmente un alcohol primario y más particularmente etanol, produce una composición más eficaz para permeabilizar paredes de microorganismos. Dicha composición posibilita en particular que ciertas macromoléculas, opcionalmente marcadas, como sondas de nucleótidos, penetren en microorganismos.

En particular ha resultado...

1. Composición para permeabilizar paredes de microorganismos, que comprende entre 5 y 95% en peso de etanol y entre 100 y 900 µg/ml de polietilenimina (PEI).

2. Composición de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizada porque la concentración de polietilenimina en la composición es entre 200 y 800 µg/ml.

3. Composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque comprende entre 5 y 50% y preferiblemente entre 10 y 50% de etanol.

4. Método para contar y/o identificar sobre una membrana los microorganismos inicialmente presentes en un medio líquido o gaseoso, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

(a) filtrar el medio líquido o gaseoso a través de una membrana para retener en o sobre la membrana los microorganismos presentes en ese medio,
(b) poner en contacto la membrana y los microorganismos con una composición permeabilizante como la antes descrita que comprende polietilenimina (PEI) y por lo menos un alcohol,
(c) fijar las células a la membrana por medio de un agente reticulante,
(d) poner en contacto los microorganismos con una o más macromoléculas, opcionalmente marcadas, capaces de reticularse a la pared de los microorganismos, y
(e) realizar la detección de las moléculas que han penetrado en los microorganismos.

5. Método de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque comprende, entre la etapa (a) y la etapa (b), una etapa adicional que consiste en el cultivo de los microorganismos.

6. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 y 5, caracterizado porque el agente que actúa como agente reticulante en la etapa (c) se elige de glutaraldehído, formaldehído y paraformaldehído.

7. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque, en la etapa (d), la macromolécula usada es una sonda del tipo de PNA.

8. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque, en la etapa (d), la macromolécula usada es una sonda del tipo de oligonucleótidos.

9. Método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7 y 9, caracterizado porque la sonda usada en la etapa (d) comprende una secuencia que presenta por lo menos 80% de identidad con las secuencias SEQ ID nº 1, SEQ ID nº 2 ó SEQ ID nº 3.

10. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, caracterizado porque, en la etapa (d), las sondas o los cebadores se marcan por acoplamiento con una enzima que permite la emisión de una señal luminosa.

11. Método de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque la detección de los microorganismos en la etapa (e) se realiza por medio de una reacción de quimioluminiscencia y reconocimiento de la señal luminosa emitida por medio de una interfaz apropiada.

12. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 9, caracterizado porque, en la etapa (d), las sondas o los cebadores se marcan con una molécula fluorescente.

13. Método de acuerdo con la reivindicación 12, caracterizado porque la detección de los microorganismos en la etapa (e) se realiza detectando la señal de fluorescencia emitida, correspondiente al marcaje de la sonda o del cebador, por medio de una interfaz apropiada.

14. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 13, caracterizado porque comprende, entre la etapa (d) y la etapa (e), una etapa adicional que consiste en la hibridación específica de las sondas o de los cebadores con los ácidos nucleicos de los citados microorganismos.

15. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 14, caracterizado porque comprende, entre la etapa (d) y la etapa (e), una etapa adicional que consiste en la amplificación específica de los ácidos nucleicos presentes en los microorganismos.

16. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 15, caracterizado porque la membrana sobre la que se detectan los microorganismos es principalmente de PVDF o de nailon®.

17. Método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 16, caracterizado porque la composición permeabilizante de la etapa (b) comprende la combinación de PEI y etanol.

18. Método de acuerdo con la reivindicación 17, caracterizado porque la citada combinación permeabilizante es una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

19. Uso de una combinación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la citada composición se usa para incrementar la permeabilidad de las paredes de microorganismos.

20. Uso de una combinación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la citada composición se usa en un método para contar y/o identificar microorganismos.

21. Uso de una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la citada composición se usa para hacer que penetren macromoléculas en una célula aislada.

22. Estuche para detectar y contar microorganismos, caracterizado porque comprende:

- una membrana para filtrar un líquido y

- una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

23. Estuche de acuerdo con la reivindicación 22, caracterizado porque comprende también una composición que comprende un agente reticulante elegido de glutaraldehído, formaldehído y paraformaldehído.

24. Estuche de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 23, caracterizado porque comprende también por lo menos una sonda para la detección específica de microorganismos.

25. Estuche de acuerdo con la reivindicación 24, caracterizado porque la sonda para la detección específica de microorganismos comprende una secuencia que presenta por lo menos 80% de identidad con las secuencias SEQ ID nº 1, SEQ ID nº 2 ó SEQ ID nº 3.

26. Estuche de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, caracterizado porque la membrana es principalmente de PVDF o de nailon®.