PROCEDIMIENTO PARA DETECTAR UN MARCADOR DE CANCER DE COLON.
Un procedimiento para detectar cáncer de colon detectando COX-2 a partir de heces,
que comprende los siguientes procedimientos:
a) un procedimiento para homogeneizar las heces recogidas en presencia de un inhibidor de RNasa, para preparar una suspensión de las mismas; implicando dicho procedimiento ningún procedimiento para separar los componentes celulares de las heces;
b) un procedimiento para extraer el ARN de la suspensión obtenida en a);
c) un procedimiento para transcribir de forma inversa el ARN extraído para dar ADNc;
d) un procedimiento para amplificar el ADNc obtenido; y
e) un procedimiento para detectar la COX-2 a partir del ADNc amplificado
Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W03011972JP.
Solicitante: HAMAMATSU FOUNDATION FOR SCIENCE AND TECHNOLOGY PROMOTION.
Nacionalidad solicitante: Japón.
Dirección: HAMAMATSU CAMPUS, SHIZUOKA UNIVERSITY, 3-5-1 JOHOKU,HAMAMATSU-SHI, SHIZUOKA 432-85.
Inventor/es: KANAOKA,SHIGERU.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 9 de Diciembre de 2009.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/68A4
- C12Q1/68M6B
- G01N33/574C6
Clasificación PCT:
- C12N15/10 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34).
- C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
- G01N33/48 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Material biológico, p. ej. sangre, orina (G01N 33/02, G01N 33/26, G01N 33/44, G01N 33/46 tienen prioridad ); Hemocitómetros (cómputo de glóbulos repartidos sobre una superficie por barrido óptico de la superficie G06M 11/02).
- G01N33/50 G01N 33/00 […] › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre o de orina; Ensayos mediante métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Ensayos inmunológicos (procedimientos de medida o ensayos diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto, procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
Clasificación antigua:
- G01N33/48 G01N 33/00 […] › Material biológico, p. ej. sangre, orina (G01N 33/02, G01N 33/26, G01N 33/44, G01N 33/46 tienen prioridad ); Hemocitómetros (cómputo de glóbulos repartidos sobre una superficie por barrido óptico de la superficie G06M 11/02).
- G01N33/50 G01N 33/00 […] › Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre o de orina; Ensayos mediante métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Ensayos inmunológicos (procedimientos de medida o ensayos diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto, procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q).
Fragmento de la descripción:
Procedimiento para detectar un marcador de cáncer de colon.
La presente invención se refiere a un procedimiento para detectar un marcador tumoral para diagnosticar el cáncer de colon que comprende un procedimiento para extraer el ARN de una muestra biológica, caracterizado porque no implica ningún procedimiento para separar los componentes celulares de la muestra biológica.
Antecedentes de la invención
Las muertes por cáncer de colon están aumentando. La cantidad de muertes por cáncer de colon es la cuarta mayor entre las muertes de hombres, y la segunda mayor entre las muertes de mujeres en todas las muertes por cáncer (Statistics of Japanese cancer deaths in 1999 (Estadística de muertes por cáncer en Japón en 1999)). De acuerdo con una estimación de los pacientes de cáncer en 2015 en Japón, se estima que la cantidad de pacientes con cáncer de colon será la primera tanto en hombres como en mujeres. Por tanto se requieren medidas globales para contrarrestar el cáncer de colon incluyendo prevención secundaria, y la exploración en masa de cáncer puede ser uno de los procedimientos más eficaces.
Para la exploración en masa de cáncer, es importante que el procedimiento de detección sea fácil y no invasivo. El único procedimiento no invasivo ahora disponible es el procedimiento para examinar la existencia de sangre oculta en las heces, es decir, el ensayo de sangre oculta fecal, y se usa extensivamente como procedimiento convencional de la exploración en masa de cáncer de colon.
Sin embargo, el ensayo de sangre oculta fecal tiene sensibilidad y especificidad bastante baja (la sensibilidad: del 30 al 90%, la especificidad: del 70 al 98%), porque la aparición de hemoglobina en heces no es específica de tumor. Por lo tanto, hay una deficiencia de que existen bastantes falsos negativos y falsos positivos.
Además, en el diagnóstico de cáncer de colon, después de o en paralelo con la exploración por el ensayo inmunológico de sangre oculta fecal, se ha adoptado colonoscopia total o una combinación de Ba-enema y sigmoidoscopia. Por tanto hay una deficiencia de que se necesita mucho tiempo y esfuerzo.
Como procedimientos alternativos al ensayo de sangre oculta fecal, se ha informado de procedimientos que usan ADN, tales como la detección de mutaciones en los genes K-ras, p-53, o APC, o la detección de inestabilidad de microsatélites en heces (D. Sidransky, y col., Science, 256, 3 de abril, 1992, 102-105; S. M. Dong, y col., Journal of the National Cancer Institute, 93 (11), 11 de junio, 2001, 858-865; G. Traverso, y col., The New England Journal of Medicine, 346 (5), 31 de enero, 2002, 311-320; G. Traverso, y col., The Lancet, 359, 2 de febrero, 2002, 403-404).
Estos procedimientos que usan ADN son no invasivos y pueden capturar los cambios directos en las células cancerosas, y tienen características de elevada especificidad, y por tanto se considera que son procedimientos prometedores en el futuro. Sin embargo, tienen el demérito de que la sensibilidad es más baja en comparación con el ensayo de sangre oculta fecal, una técnica anterior, y conllevan bastante tiempo y esfuerzo.
Además, como procedimiento alternativo al ensayo de sangre oculta fecal, para detectar la expresión génica más directamente, se ha desarrollado un procedimiento para detectar el ARNm de la proteína quinasa C (PKC) o similares en las heces (L. A. Davidson, y col., Carcinogenesis, 19(2), 1998, 253-257; R. J. Alexander y R. F. Raicht, Digestive Diseases and Sciences, 43(12), 1998, 2652-2658; T. Yamao, y col., Gastroenterology, 114(6), 1998, 1198-1205).
Sin embargo, el procedimiento que hace uso del ARN descrito anteriormente podría no tener una sensibilidad que exceda la del procedimiento de ensayo de sangre oculta fecal, porque era imposible extraer ARN fácilmente y de forma eficaz de una pequeña cantidad de heces.
Se ha conocido un procedimiento para detectar ARN de forma cualitativa y cuantitativa combinando el procedimiento de PCR con la reacción de la transcriptasa inversa (RT). Este procedimiento de RT-PCR es superior a la técnica de transferencia de Northern en la elevada sensibilidad para poder detectar moléculas traza, y es más ventajoso que la técnica de hibridación in situ en velocidad y facilidad de manipulación.
Sin embargo, como el ARN es más inestable en comparación con el ADN y siempre está sometido a un peligro de descomposición por enzimas de digestión del ARN (RNasas) que son ubicuas en todas las muestras biológicas y muy estables, es necesario un control estricto para evitar la contaminación de RNasas en el procedimiento de RT-PCR, durante y después de los procedimientos de purificación del ARN.
Por lo tanto, cuando se extrae ARN de las heces, que es una muestra biológicamente muy rudimentaria, ha sido necesario un procedimiento para separar la fracción celular por adelantado, para excluir los efectos de las RNasas.
Por consiguiente, se ha considerado imposible extraer ARN directamente de heces que contienen una enorme cantidad de RNasas derivadas de una cantidad muy grande de microorganismos y, se ha considerado que la separación de la fracción celular es esencial para eliminar al menos las RNasas exógenas derivadas de los microorganismos o similares.
Sorprendentemente, sin embargo, el inventor de la presente invención descubrió que, en algunos casos, la homogeneización de materiales biológicos congelados en presencia de inhibidores de RNasa puede resolver los problemas descritos anteriormente, y ha completado la presente invención.
Sumario de la invención
Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento para detectar un marcador tumoral, no invasivo y conveniente, para diagnosticar el cáncer de colon, en el que dicho marcador tumoral es COX-2, que sea superior en sensibilidad y especificidad al ensayo de sangre oculta fecal existente.
La presente invención es un procedimiento para detectar el cáncer de colon detectando COX-2, que comprende el siguiente procedimiento;
a) un procedimiento para homogeneizar la muestra biológica recogida en presencia de un inhibidor de RNasa para preparar una suspensión de la misma;
caracterizado porque no implica ningún procedimiento para separar los componentes celulares de la muestra biológica.
Aquí, dicha muestra biológica recogida está preferiblemente congelada.
Además, la presente invención es el procedimiento descrito anteriormente, en el que el inhibidor de RNasa es tiocianato de guanidina.
Además, la presente invención es el procedimiento descrito anteriormente, en el que la muestra biológica es heces.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra un resultado de una electroforesis del Ejemplo 2. El carril 1 muestra el ARN total extraído de heces humanas con el procedimiento de Alexander y col. El carril 2 muestra el ARN total extraído de heces humanas con el procedimiento de la presente invención. El carril 3 muestra el ARN total extraído de un tejido de cáncer de colon humano. El carril M muestra los marcadores de peso molecular.
El mejor modo para realizar la invención
En cuanto a los inhibidores de RNasa de la presente invención, se incluyen tiocianato de guanidina, Isogene, Ultraspec II (una marca comercial registrada) y similares.
Las muestras biológicas de la presente invención son heces, y más preferiblemente heces humanas.
Las muestras biológicas de la presente invención pueden usarse como tales o, en algunos casos, después de congelarlas.
Los procedimientos de congelación pueden ser cualquier procedimiento convencional, y preferiblemente un procedimiento que usa nitrógeno líquido. La temperatura de congelación (y conservación) es de -1 a -196ºC, preferiblemente de -20 a -196ºC, preferiblemente de -75 a -196ºC, más preferiblemente de -110 a -196ºC, y mucho más preferiblemente de -196ºC.
La muestra congelada puede conservarse en estado congelado. La temperatura de conservación es de -75 a -196ºC, preferiblemente de -110 a -196ºC, y más preferiblemente de -196ºC. El periodo de conservación es de un día a 10 años, preferiblemente de un día a 3 años, y más preferiblemente de un día a un año.
El marcador tumoral usado en la presente invención es COX-2, metaloproteasa de matriz (MMP), c-met, variantes de CD44, EGF-R, EF-1, Wnt-2, Bradeiona, SKP2, KPC-1, KPC-2, PRL-3, Angiogenina, Integrina, Snail, Desadherina,...
Reivindicaciones:
1. Un procedimiento para detectar cáncer de colon detectando COX-2 a partir de heces, que comprende los siguientes procedimientos:
a) un procedimiento para homogeneizar las heces recogidas en presencia de un inhibidor de RNasa, para preparar una suspensión de las mismas; implicando dicho procedimiento ningún procedimiento para separar los componentes celulares de las heces;
b) un procedimiento para extraer el ARN de la suspensión obtenida en a);
c) un procedimiento para transcribir de forma inversa el ARN extraído para dar ADNc;
d) un procedimiento para amplificar el ADNc obtenido; y
e) un procedimiento para detectar la COX-2 a partir del ADNc amplificado.
2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el inhibidor de RNasa es tiocianato de guanidina.
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