Un procedimiento para recuperar una molécula de ácido nucleico que codifica un miembro de unión de un complejo internalizado en una célula eucariota,

que comprende las siguientes etapas de: (a) poner en contacto una célula eucariota con una colección diversa de partículas de bacteriófago, en la que cada una o sustancialmente todas dichas partículas de bacteriófago presentan un miembro de unión en su superficie, en la que dicho miembro de unión se presenta como un (poli)péptido que no es de fusión con una proteína de cubierta de fago de dicha partícula de bacteriófago y en la que cada una o sustancialmente todas dichas partículas de bacteriófago comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica el miembro de unión presentado, (b) permitir la unión del miembro de unión presentado sobre la partícula de bacteriófago a su diana, permitiendo de esta manera la formación de al menos un complejo, comprendiendo cada uno de dichos complejos una partícula de bacteriófago con su miembro de unión presentado y su diana, (c) cultivar la célula en condiciones que permitan la internalización de al menos uno de dichos complejos en la célula, (d) eluir las moléculas de ácido nucleico que codifican un miembro de unión que no se internaliza en condiciones en las que sustancialmente no se produce lisis celular, (e) lisar la célula que comprende los complejos internalizados y (f) recuperar a partir de la célula lisada la molécula de ácido nucleico que codifica un miembro de unión derivado de al menos uno de los complejos internalizados

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se han identificado nuevas dianas mediante análisis comparativos y estadísticos de pacientes sanos y enfermos, en particular mediante el análisis de tejidos y/o plasma procedente de sangre de dichos pacientes. Normalmente, el análisis comparativo puede realizarse sobre diferentes niveles, tales como sobre los niveles de ADN, ARN, proteínas y postraduccionales. Una técnica usada comúnmente se basa en el análisis de la expresión diferencial de genes. En resumen, se marca ARNm procedente de células enfermas y sanas y posteriormente se hibrida con un chip de genes y se cuantifica. La regulación positiva o negativa de diferentes ARNm, basada en las señales de cuantificación, revela nuevas dianas potenciales. Otra estrategia bien conocida en la técnica anterior se basa en la identificación y comparación de patrones de metilación de ADN de moléculas de ADN procedentes de pacientes sanos y enfermos.

Sin embargo, en el contexto anterior debe entenderse que ni la modificación de ADN (es decir, el patrón de metilación de ADN) ni el análisis de expresión diferencial de genes (es decir el nivel de ARNm expresado en una célula) necesariamente refleja si una proteína específica codificada por el ADN correspondiente o el ARNm correspondiente efectivamente se expresa. Por lo tanto, sigue siendo un desafío la identificación de niveles de expresión diferencial, es decir, el análisis cuantitativo y también cualitativo de patrones de expresión de proteínas de células sanas en comparación con células enfermas.

Un procedimiento para la identificación de niveles de expresión diferencial de proteínas se basa en el análisis diferencial en gel bidimensional de dichas proteínas con el análisis posterior por espectrometría de masas, una técnica bien conocida para el experto en la materia. Además, son bien conocidos para un experto en la materia procedimientos basados en la fraccionación de proteínas tales como, mencionando sólo algunos, técnicas basadas en el uso de chips de proteínas y técnicas relacionadas con HPLC y FPLC.

Las técnicas de presentación en fagos ofrecen, por ejemplo, la posibilidad de reducir una biblioteca grande, por ejemplo, una biblioteca de expresión de miembros de unión, en muestras, tales como tejidos o células que, por ejemplo, proceden de un donante sano, y usar la población residual de la biblioteca en muestras, tales como tejidos o células, que proceden, por ejemplo, de un donante enfermo. Los miembros de unión que se han rastreado mediante el análisis de reducción, es decir, que se unen a dianas (poli)peptídicas u homólogos de tejidos/células enfermas pero no de tejidos/células sanas, normalmente se considera que se unen a una diana que se expresa de forma única (o al menos en un nivel mucho mayor) en las células diana (por ejemplo, la célula enferma). Posteriormente, pueden identificarse complejos de miembro de unión/diana (poli)peptídica, por ejemplo, por espectrometría de masas o procedimientos para el análisis de proteínas bien conocidos para el experto en la materia.

Son de un interés particular miembros de unión que se internalizan tras la unión a su diana. Dichos miembros de unión de internalización se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, el documento WO 99/55367 o Biochimica et Biophysica Acta 1591 (2002) 109-118). Sin embargo, dichos miembros de unión se descubrieron por procedimientos diferentes de los procedimientos superiores descritos por la presente invención. Un experto en la materia sabe que dichos miembros de unión pueden, por ejemplo, fusionarse a cualquier sustancia o cualquier molécula pequeña que podría ser tóxica para la célula, desencadenando de esta manera la destrucción de la célula, preferentemente enferma, que expresa dicha o dichas dianas, siendo preferentemente dicha célula una célula enferma. Como también es conocido en la técnica, una vez que una diana de interés que se internaliza se ha identificado como, por ejemplo, una célula enferma o cancerosa, es posible determinar miembros de unión adicionales con, por ejemplo, mayor afinidad por la diana y/o mayor potencial para desencadenar la internalización de dicha diana. Dichos miembros de unión mejorados entonces pueden considerarse, por ejemplo, fármacos para tratar, por ejemplo, células enfermas que expresan dicha o dichas dianas.

Para determinar eficazmente las dianas potenciales que se han internalizado en la célula tras la unión de su miembro de unión respectivo, sería deseable separar los complejos internalizados de los complejos no internalizados. Sin embargo, en la técnica anterior, dicha separación no se ha conseguido de una manera satisfactoria cualitativa y cuantitativa confrontando de esta manera al experto en la materia con técnicas que requieren mucho tiempo y complejas para determinar miembros de unión y dianas que se internalizan.

Por lo tanto, sigue existiendo la necesidad de desarrollar adicionalmente y también mejorar procedimientos y procesos que permitan una separación eficaz entre complejos internalizados y no internalizados.

La presente invención satisface esta necesidad presentando miembros de unión como polipéptidos que no son de fusión sobre proteínas de la cubierta de fagos bacterianos. Esto puede conseguirse por diversos sistemas de presentación, por ejemplo, los desvelados en el documento WO 01/05950. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La Figura 1 muestra la eficacia de la internalización de dianas tras la unión a Fab.

Se calculó el porcentaje (%) de internalización a partir de la relación de señal extracelular en la superficie celular a 4ºC frente a 37ºC; la recuperación de la fluorescencia se midió mediante la relación de tinción extracelular más intracelular a 4ºC frente a 37ºC, mostrando que no se perdía ninguna o sólo se perdían unas pocas partículas de fago durante el proceso de internalización, el tratamiento con saporina y/o la tinción. Fab A mostró una internalización del 80%, Fab B sólo se internalizó con un 20% y Fab C no mostró ninguna unión en absoluto.

La Figura 2 muestra la eficacia de la internalización de complejos de fago y diana y la reducción del fago unido a la superficie por DDT.

Se muestra la internalización de fagos que presentan a través de un enlace disulfuro Fab A contra un antígeno que predominantemente se internaliza frente a fagos que presentan a través de un enlace disulfuro un Fab B contra un antígeno que predominantemente no se internaliza.

El porcentaje (%) de internalización se calculó a partir de la relación de señal extracelular sobre la superficie celular a 4ºC frente a 37ºC; la recuperación de la fluorescencia se midió mediante la relación de tinción extracelular más intracelular a 4ºC frente a 37ºC. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere, en un aspecto, a un procedimiento para recuperar una molécula de ácido nucleico que codifica un miembro de unión de un complejo internalizado en una célula, que comprende las siguientes etapas de (a) poner en contacto una célula con una colección diversa de partículas de bacteriófago, en la que cada una o sustancialmente todas dichas partículas de bacteriófago presentan un miembro de unión en su superficie, en la que dicho miembro de unión se presenta como un (poli)péptido que no es de fusión con una proteína de cubierta de fago de dicha partícula de bacteriófago y en la que cada una o sustancialmente todas dichas partículas de bacteriófago comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica el miembro de unión presentado, (b) permitir la unión del miembro de unión presentado sobre la partícula de bacteriófago a su diana, permitiendo de esta manera la formación de al menos un complejo, comprendiendo cada uno de dichos complejos una partícula de bacteriófago con su miembro de unión presentado y su diana, (c) cultivar la célula en condiciones que permitan la internalización de al menos uno de dichos complejos en la célula, (d) eluir las moléculas de ácido nucleico que codifican un miembro de unión que no se internaliza en condiciones en las que sustancialmente no se produce lisis celular, (e) lisar la célula que comprende los complejos internalizados y (f) recuperar a partir de la célula lisada la molécula de ácido nucleico que codifica un miembro de unión derivado de al menos uno de los complejos internalizados.

El término “célula” se refiere a cualquier célula eucariota o procariota. En relación con la presente invención se prefieren las células de mamífero....

1. Un procedimiento para recuperar una molécula de ácido nucleico que codifica un miembro de unión de un complejo internalizado en una célula eucariota, que comprende las siguientes etapas de:

(a) poner en contacto una célula eucariota con una colección diversa de partículas de bacteriófago, en la que cada una o sustancialmente todas dichas partículas de bacteriófago presentan un miembro de unión en su superficie, en la que dicho miembro de unión se presenta como un (poli)péptido que no es de fusión con una proteína de cubierta de fago de dicha partícula de bacteriófago y en la que cada una o sustancialmente todas dichas partículas de bacteriófago comprenden una molécula de ácido nucleico que codifica el miembro de unión presentado,

(b) permitir la unión del miembro de unión presentado sobre la partícula de bacteriófago a su diana, permitiendo de esta manera la formación de al menos un complejo, comprendiendo cada uno de dichos complejos una partícula de bacteriófago con su miembro de unión presentado y su diana,

(c) cultivar la célula en condiciones que permitan la internalización de al menos uno de dichos complejos en la célula,

(d) eluir las moléculas de ácido nucleico que codifican un miembro de unión que no se internaliza en condiciones en las que sustancialmente no se produce lisis celular,

(e) lisar la célula que comprende los complejos internalizados y

(f) recuperar a partir de la célula lisada la molécula de ácido nucleico que codifica un miembro de unión derivado de al menos uno de los complejos internalizados.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de determinar la secuencia de la diana del complejo internalizado.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que dicha presentación como (poli)péptido de no fusión se caracteriza por un enlace no peptídico entre la proteína de cubierta de fago y el miembro de unión.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que dicho enlace no peptídico es un enlace disulfuro.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que dicho enlace disulfuro se genera entre

un primer resto de cisteína comprendido en dicha proteína de cubierta de fago y un segundo resto de cisteína comprendido en dicho miembro de unión.

6. El procedimiento de la reivindicación 4 ó 5, en el que dicha etapa de elución de dichas

5 moléculas de ácido nucleico que codifican un miembro de unión que no se internaliza se realiza en condiciones reductoras de tal forma que se escinde dicho enlace disulfuro.

7. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha

recuperación de la célula lisada de dicha molécula de ácido nucleico que codifica el miembro 10 de unión se consigue por PCR.

8. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que dicha etapa de determinación de la secuencia de la diana en el complejo internalizado se consigue por espectrometría de masas.