Método de inmunoensayo homogéneo para detectar y cuantificar simultáneamente niveles de anticuerpos de inmunoglobulinas específicas contra una pluralidad de alérgenos en una muestra de sangre,

que comprende

(a) poner en contacto una muestra de sangre que tiene un volumen de 1 a 25 µl con una pluralidad de partículas acopladas a una pluralidad de alérgenos, las partículas estando en suspensión en 1 a 50 µl de un medio acuoso, cada combinación de partículas con alérgeno específico siendo distinguible de combinaciones de partículas con otros alérgenos, en condiciones en las que los anticuerpos de inmunoglobulinas presentes en la muestra de sangre que se unen específicamente a uno o más de los alérgenos se unen a las partículas;

(b) después de eso, poner en contacto los materiales de la etapa (a) con un primer conjugado que comprende un anticuerpo anti-humano IgE o IgG conjugado con biotina;

(c) después de eso, poner en contacto los materiales de la etapa (b) con un segundo conjugado que contiene una porción fluorófora unida a avidina o estreptavidina, siendo el peso molecular del segundo conjugado de 400.000 a 1.000.000 de Daltons; y siendo la proporción molar del primer conjugado respecto al segundo conjugado de 1:1 a 1:5; y

(d) después de eso, determinar los niveles de anticuerpos de inmunoglobulinas específicas en los materiales de la etapa (c), determinando simultáneamente las señales de emisión fluorescente de los subconjuntos de partículas y midiendo las señales de emisión fluorescente de la porción fluorófora

Inmunoensayos homogéneos para múltiples alérgenos.

Antecedentes de la invención

Esta invención se refiere a un método de inmunoensayo homogéneo para determinar niveles de anticuerpos específicos contra una multiplicidad de alérgenos a partir de una muestra de sangre, o para determinar los niveles de inmunoglobulinas E totales en dicha muestra, con el fin de diagnosticar una alergia.

El término "alergia" es sinónimo de atopia o hipersensibilidad y es el resultado de una reacción inmunológicamente mediada por los individuos contra diversos materiales antigénicos, conocidos como alérgenos. Las personas con alergias producen inmunoglobulinas específicas de alérgeno, IgE e IgG, en respuesta a la exposición a sustancias normalmente inofensivas de pólenes, mohos, caspa o alimentos que se inhalan o se ingieren. Los anticuerpos generados se liberan para su circulación en la sangre y finalmente se fijan a células específicas en tejidos. Generalmente, la exposición a alérgenos da como resultado reacciones inmediatas o retardadas, que se manifiestan con varios síntomas comúnmente identificables tales como estornudos, picor de ojos, rinorrea e inflamación de los pulmones y de las fosas nasales. Generalmente, el término "alergia" también es sinónimo de fiebre del heno, rinitis, eccema, urticaria, y está relacionado con la aparición de asma. El diagnóstico de alergia implica una revisión de la historia del paciente, exámenes físicos y realización de un ensayo de diagnóstico confirmatorio para identificar si los síntomas del paciente son de origen alérgico o no alérgico. Si una alergia es responsable de los síntomas, entonces deben identificarse los alérgenos responsables. Los pacientes con enfermedades atópicas o alérgicas pueden ser monosensibles a un alérgeno; sin embargo, la sensibilización a múltiples alérgenos es más habitual. Las reacciones de las personas a alérgenos pueden variar de las molestas a las graves o incluso mortales. Por lo tanto, es deseable ser capaz de determinar, no sólo si una persona tiene alergias, sino de ser así, a qué alérgenos y en qué nivel de gravedad, de modo que pueda evitarse, minimizarse o mitigarse la exposición por métodos farmacoterapéuticos o inmunoterapéuticos.

El ensayo de diagnóstico confirmatorio puede realizarse mediante un ensayo cutáneo in vivo, un ensayo de provocación in vivo o un ensayo in vitro para determinar la presencia de anticuerpos específicos contra alérgenos circulantes a partir de muestras de sangre. La provocación directa, por inhalación o ingestión directa de alérgenos que posiblemente actúan como agentes causales, aunque relevante, es desagradable, posiblemente peligrosa y no puede realizarse para múltiples alérgenos de una vez.

El ensayo cutáneo (también denominado ensayo de escarificación o ensayo de punción cutánea) es un procedimiento in vivo que implica aplicar una muestra de alérgeno, o más generalmente una multiplicidad de alérgenos, directamente en el antebrazo o la espalda de un paciente por medio de una pequeña lesión de raspado con aguja y medir el tamaño de la reacción inflamatoria (habón) en el sitio de aplicación en la piel. El ensayo de punción cutánea, usado ampliamente, es fiable en condiciones de ensayo óptimas, puede ser doloroso, está sujeto a grandes diferencias en la técnica y las interpretaciones y no puede usarse en pacientes que toman determinados fármacos o pacientes con problemas cutáneos. Además, los métodos de diagnóstico in vivo tanto de provocación como de punción cutánea tienen el potencial de sensibilizar a los pacientes a nuevos alérgenos y, en casos extremos, generar una reacción anafiláctica potencialmente mortal tras la exposición directa al alérgeno o alérgenos causales.

Los métodos de ensayo de diagnóstico in vitro miden directamente los niveles circulantes de anticuerpos específicos contra alérgenos en una muestra de sangre obtenida de pacientes. Generalmente, estos métodos son procedimientos de inmunoensayo que son reproducibles, son equivalentes en sensibilidad y especificidad a ensayos de punción cutánea bien realizados, no se ven afectados por ninguno de los factores que impiden el uso de cualquiera de los dos métodos in vivo y no causan acontecimientos anafilácticos. Las técnicas de inmunoensayo capaces de medir niveles de anticuerpos específicos contra alérgenos individuales se han empleado durante muchos años (Johansson, S. G. O. y Yman, L., In vitro assay for immunoglobulin E, Coin. Rev. Allergy 6, 93-139, 1988). Como alternativa, los métodos que miden niveles específicos de alérgenos contra una pluralidad de alérgenos simultáneamente han proporcionado exámenes de alergias más útiles como se describe, por ejemplo, en las patentes de Estados Unidos 4.459.360 y 5.082.768. La patente de Estados Unidos 6.087.188 describe un método de detección de un anticuerpo en una muestra usando partículas paramagnéticas y un compuesto de acridinio quimioluminiscente unido a avidina o estreptavidina. Se indica que el método descrito en esta patente es útil para la detección de alérgenos. Sin embargo, el método se limita a la detección de un solo alérgeno en una muestra dada.

En el campo del diagnóstico clínico, existe una amplia categoría de métodos disponibles para determinar una lista en expansión de analitos clínicamente pertinentes. Una de estas categorías son los inmunoensayos, que se usan actualmente para determinar la presencia o la concentración de diversos analitos en muestras biológicas, de forma tanto conveniente como fiable (The Immunoassay Handbook, editado por David Wild, M Stockton Press, 1994). Los inmunoensayos utilizan agentes de unión específicos contra analitos diana en fluidos, donde al menos uno de dichos agentes de unión está generalmente marcado con una diversidad de compuestos, incluyendo radioisótopos, enzimas y compuestos fluorescentes o quimioluminiscentes, que pueden medirse por las desintegraciones radioactivas, los sustratos productores de color inducidos enzimáticamente, la emisión o la inhibición de fluorescencia y la emisión de luz quimioluminiscente. Dichos agentes de unión específicos incluyen típicamente anticuerpos específicos de analito (inmunoglobulinas) y fragmentos de anticuerpos, receptores, lectinas y anticuerpos artificiales modificados químicamente o por ingeniería genética. Los métodos de inmunoensayo destacados incluyen, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) (Enzyme-Immunoassay, Edward T. Maggio, CRC Press, 1980), inmunoensayo fluorescente (FIA) y ensayos quimioluminiscentes (CLA) (Luminescent Assays, Perspectives in Endocrinology and Clinical Chemistry, Vol. 1, Mario Serio y Mario Pazzagli, Raven Press, 1982), (Bioluminescence and Chemiluminescense, Basic Chemistry and Analytical Applications, Marlene, A. DeLuca y William D. McElroy, Academic Press, 1981), (Journal of Bioluminiscence, Vol. 4, M. Pazzagli, et al., Proceedings of the Vth International Symposium-on-Bioluminiscence and Chemiluminiscence, Wiley, 1989), etc. Están disponibles numerosas variaciones de métodos y dispositivos para realizar dichos ensayos, los conocen los expertos en la materia y pueden encontrarse en la bibliografía científica y de patentes.

Los inmunoensayos pueden ser heterogéneos u homogéneos. Los inmunoensayos heterogéneos se han aplicado a analitos tanto de bajo peso molecular como de alto peso molecular y requieren la separación de los materiales unidos (a detectar o determinar) de los materiales libres (que pueden interferir con esa determinación). Los inmunoensayos heterogéneos pueden comprender un anticuerpo o un antígeno inmovilizado sobre superficies sólidas tales como placas de microtitulación de plástico, perlas, tubos o similares o sobre láminas de membrana, microplacas y fragmentos de vidrio, nylon, celulosa o similares (Immobilized Enzymes, Antigens, Antibodies, and Peptides, Howard H. Weetall, Marcel Dekker, Inc., 1975). En los inmunoensayos heterogéneos, los complejos de antígeno-anticuerpo unidos a la fase sólida se separan del analito inespecífico y que no ha reaccionado en solución, generalmente por centrifugación, filtración, precipitación, separación magnética o aspiración de los líquidos de las fases sólidas, seguido de lavado repetido del complejo antígeno-anticuerpo unido a la fase sólida. Son de interés particular los ensayos tipo "sándwich" inmunométricos (Immunochemistry of Solid-Phase Immunoassay, John E. Butler, CRC Press, 1991) que primero requieren...

1. Método de inmunoensayo homogéneo para detectar y cuantificar simultáneamente niveles de anticuerpos de inmunoglobulinas específicas contra una pluralidad de alérgenos en una muestra de sangre, que comprende

2. Método de inmunoensayo homogéneo para detectar y cuantificar los anticuerpos de inmunoglobulina E totales en una muestra de sangre, que comprende

3. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la pluralidad de partículas contiene de 10 a 40 alérgenos.

4. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el anticuerpo específico se selecciona de inmunoglobulina E, inmunoglobulina G y subclases de inmunoglobulina G.

5. Método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el fluoróforo es una ficobiliproteína.

6. Método de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la ficobiliproteína es ficoeritrina.

7. Método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la biotina se conjuga al anticuerpo IgE anti-humana en una proporción molecular de 10:1 a 30:1.

8. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa (a) se lleva a cabo poniendo en contacto la muestra con una pluralidad de partículas acopladas a de 2 a 100 alérgenos específicos.

9. Método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el anticuerpo acoplado a partículas se selecciona de IgE policlonal anti-humana.

10. Método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el anticuerpo acoplado a partículas es un fragmento de IgE anti-humana que se une específicamente a inmunoglobulina E.

11. Método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el anticuerpo acoplado a partículas es un anticuerpo monoclonal que se une específicamente a inmunoglobulina E.

12. Método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que se determinan los anticuerpos específicos de alérgeno sin diluir la muestra de sangre.

13. Método de acuerdo con la reivindicación 2, en el que la proporción molecular de anticuerpo IgE anti-humana respecto a biotina en el primer conjugado es de 1:10 a 1:30.