Inmunoensayo de 5-fluoro-uracilo.

Un inmunoensayo para detectar 5-fluoro-uracilo en una muestra,

que comprende proporcionar una mezcla de a)una muestra, b) un anticuerpo selectivamente reactivo con 5-fluorouracilo, cuyo anticuerpo tiene una reactividadcruzada relativa al 5-fluoro-uracilo con cada uno de uracilo, citosina y tegafur no mayor del 12 % y c) un conjugadode un vehículo con un compuesto de fórmula:

en la que Y es un grupo espaciador orgánico;

X es un grupo funcional terminal capaz de unirse al vehículo; y

p es un número entero de 0 a 1; o

un compuesto de fórmula:

en la que X, Y y p son como se ha definido anteriormente;

y una mezcla de los mismos;

haciendo que el 5-fluoro-uracilo de la muestra y dicho conjugado se unan con dicho anticuerpo y, tras ello, medir lacantidad de dicho conjugado de dicha mezcla que se une o no se une a dicho anticuerpo, mediante lo cual se puededeterminar la presencia de 5-fluoro-uracilo en la muestra.

Inmunoensayo de 5-fluoro-uracilo Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de los ensayos inmunológicos para determinar la presencia y/o cuantificar la cantidad de 5-fluoro-uracilo [5-FU] en muestras biológicas humanas con el fin de determinar de manera rápida las concentraciones farmacológicas óptimas durante una quimioterapia.

Antecedentes de la invención “Cáncer” es un término usado para describir un grupo de tumores malignos que comparten el rasgo común de desarrollarse cuando las células de una parte del cuerpo comienzan a crecer sin control. La mayoría de los cánceres se forman como tumores, pero también se pueden manifestar en la sangre y circular a través de otros tejidos en los que crecen. La forma más común de tratar los tumores malignos cancerosos consiste en una combinación de cirugía, quimioterapia y/o radioterapia. El tipo de tratamiento usado para tratar un determinado cáncer depende de varios factores entre los que se incluyen el tipo de tumor maligno canceroso y el estadio en el que fue diagnosticado.

El 5-FU es uno de los agentes citotóxicos más comúnmente usado para el tratamiento del cáncer de mama y colorrectal. Este agente quimioterapéutico tiene la fórmula:

Este compuesto se ha asociado con efectos secundarios debilitantes tales como la pérdida de densidad de la médula ósea, reacción mucositos, náuseas y vómitos. Mediante el control de los niveles de 5-FU en el cuerpo y el ajuste de la dosis, es posible controlar y limitar mejor estos efectos secundarios en los pacientes.

Al mismo tiempo, a menudo, existe una relación muy variable entre la dosis del 5-FU y la concentración de fármaco en suero resultante que afecta al efecto terapéutico. El grado de variabilidad farmacocinética intra- e interindividual del 5-FU puede ser tan elevado como de diez veces (Diasio et. al. J. Clin. Invest. 81: p. 47-51, 1988, Wei et. al. J. Clin. Invest. 98: p. 610-615, 1996) y se ve afectado por muchos factores que incluyen:

o la función orgánica,

o la regulación genética,

o el estado patológico,

o la edad,

o la interacción entre fármacos,

o el momento de la ingestión del fármaco,

o el modo de administración del fármaco y

o la administración en relación con la técnica.

Como resultado de esta variabilidad, las dosis iguales de un mismo fármaco en individuos diferentes pueden producir resultados clínicos espectacularmente diferentes (Hon et. al. Clinical Chemistr y 44, p. 388-400, 1988) . La eficacia de la misma dosis de 5-FU varía significativamente en base a cada aclaramiento del fármaco y a la concentración de fármaco en suero final del paciente. La administración terapéutica del fármaco proporcionaría al profesional clínico la oportunidad de comprender la variación en el paciente en la administración tanto oral como intravenosa del fármaco. Con la administración terapéutica del fármaco, se podrían individualizar las dosis de fármaco para el paciente, y las posibilidades de tratar el cáncer de una manera eficaz, sin los no deseados efectos secundarios, podrían ser mucho mayores (Nieto, Current Drug Metabolism 2: p. 53 -66, 2001) .

Además, la administración terapéutica del fármaco 5-FU serviría como una excelente herramienta para garantizar el cumplimiento de la administración de la quimioterapia con las dosis reales prescritas y el logro de niveles de concentración en suero eficaces. Se ha descubierto que la variabilidad de la concentración en suero no sólo se debe a factores fisiológicos, sino que también puede ser el resultado de la variación en la técnica de la administración y la capacidad del cuerpo para absorber el 5-FU.

Como agente quimioterapéutico, el 5-FU se puede administrar en su forma de profármaco como tegafur, que tiene la

estructura:

El tegafur, cuando se administra a un paciente, generalmente es absorbido y metabolizado por el paciente en 5-FU a distintas velocidades. Por lo tanto, en el control del nivel de 5-FU en pacientes por medio de un inmunoensayo, es importante que el inmunoensayo permita distinguir entre el tegafur, la sustancia inactiva y el 5-FU, la sustancia activa, en la que se metaboliza el tegafur. El problema con los anticuerpos contra el 5-FU es que podrían reaccionar de forma cruzada con el tegafur, inutilizando estos inmunoensayos.

La administración terapéutica rutinaria del fármaco 5-FU requeriría la disponibilidad de sencillos análisis automáticos adaptables al equipo de laboratorio general. Los análisis que mejor cumplen estos criterios son los inmunoensayos. Actualmente, no hay inmunoensayos disponibles para el 5-FU y el control de los niveles de este fármaco se lleva a cabo mediante procedimientos físicos como la cromatografía líquida de alta presión (CLAP) (Escoriaza et. al., J. of Chromatography B: Biomedical Sciences and applications, 736 (1+2) : p. 97-102, 1999) . Con el fin de ser más eficaz en el control de los niveles de fármaco, el anticuerpo debería ser más específico del 5-FU y mostrar de muy baja a ninguna reactividad cruzada hacia las bases de pirimidina relacionadas, particularmente, hacia el tegafur.

Resumen de la invención Según la presente invención, se ha producido una nueva clase de anticuerpos que reaccionan de manera sustancialmente selectiva con el 5-FU para unirse al 5-FU sin una reactividad cruzada sustancial hacia el tegafur, ni hacia otras bases de pirimidina interferentes, el uracilo y la citosina. Por selectivamente reactivo se entiende que este anticuerpo reacciona con la molécula de 5-FU y no reacciona sustancialmente con las otras bases de pirimidina interferentes tales como los análogos de 5-FU, siendo la base de pirimidina bloqueadora más importante el tegafur. Al proporcionar un anticuerpo que no reacciona sustancialmente de forma cruzada con el tegafur, se permite proporcionar un inmunoensayo para el 5-FU que puede controlar con precisión los niveles de 5-FU para el tratamiento terapéutico de pacientes que se están tratando con el 5-FU.

Se ha descubierto que mediante el uso de inmunógenos que son conjugados de un polímero de poliamina inmunogénico con un compuesto de fórmula:

en la que Y es un grupo espaciador orgánico; X es un grupo funcional terminal capaz de unirse a un polímero de poliamina; y p es un número entero de 0 a 1; se producen anticuerpos que son específicos del 5-FU y no reaccionan sustancialmente con ni se unen al tegafur, ni a otras bases de pirimidina tales como el uracilo y la citosina. El suministro de estos anticuerpos que reaccionan de manera sustancialmente selectiva con el 5-FU y no reaccionan de manera cruzada con el tegafur permite producir un inmunoensayo que puede detectar y controlar específicamente el 5-FU en muestras de fluidos de pacientes que estén siendo tratados con 5-FU. También se incluyen en la presente invención reactivos y kits para dicho inmunoensayo. La presencia del tegafur es la causa principal de lecturas de falsos positivos que han hecho que los inmunoensayos para el 5-FU no sean adecuados.

Descripción detallada Según la presente invención, se proporciona una nueva clase de anticuerpos que reaccionan de manera sustancialmente selectiva con el 5-FU y no reaccionan sustancialmente ni reaccionan de manera cruzada con el tegafur ni con otras bases de pirimidina interferentes tales como uracilo y citosina. Se ha descubierto que con el uso del derivado de 5-FU 3-substituido de fórmula II-A como inmunógeno, se proporciona esta nueva clase de anticuerpos de la presente invención. Es mediante el uso de estos anticuerpos que se ha desarrollado un inmunoensayo, incluyendo reactivos y kits para dicho inmunoensayo, para detectar y/o cuantificar el 5-FU en muestras de sangre, plasma u otros fluidos corporales. Mediante el uso de este inmunoensayo, se puede detectar y/o cuantificar la presencia y la cantidad de 5-FU en muestras de fluidos corporales, preferentemente, en una muestra de sangre o de plasma. De esta manera, se puede hacer un seguimiento de un paciente que esté siendo tratado con 5-FU durante una terapia y ajustar su tratamiento según dicho seguimiento. Por medio de la presente invención, se consigue la administración terapéutica del fármaco de 5-FU en pacientes con cáncer que estén siendo tratados con 5-FU como agente quimioterapéutico.

Los reactivos utilizados en el inmunoensayo de la presente invención son conjugados de un vehículo con el compuesto de 5-FU 1-sustituido de fórmula II-B:

en la que p, Y y X son como se definen anteriormente;

o un compuesto de fórmula:

en la que Y es un grupo espaciador orgánico; X es un grupo funcional terminal capaz de unirse a un... [Seguir leyendo]

1. Un inmunoensayo para detectar 5-fluoro-uracilo en una muestra, que comprende proporcionar una mezcla de a) una muestra, b) un anticuerpo selectivamente reactivo con 5-fluorouracilo, cuyo anticuerpo tiene una reactividad cruzada relativa al 5-fluoro-uracilo con cada uno de uracilo, citosina y tegafur no mayor del 12 % y c) un conjugado de un vehículo con un compuesto de fórmula:

en la que Y es un grupo espaciador orgánico; X es un grupo funcional terminal capaz de unirse al vehículo; y p es un número entero de 0 a 1; o un compuesto de fórmula:

en la que X, Y y p son como se ha definido anteriormente;

y una mezcla de los mismos;

haciendo que el 5-fluoro-uracilo de la muestra y dicho conjugado se unan con dicho anticuerpo y, tras ello, medir la 15 cantidad de dicho conjugado de dicha mezcla que se une o no se une a dicho anticuerpo, mediante lo cual se puede determinar la presencia de 5-fluoro-uracilo en la muestra.

2. Un inmunoensayo según la reivindicación 1, en el que p es 0 en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de fórmula II-B.

3. Un inmunoensayo según la reivindicación 1, en el que p es 1 en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de 20 fórmula II-B.

4. Un inmunoensayo según la reivindicación 3, en el que Y es alquileno que contiene de 1 a 10 átomos de carbono,

o en la que n y o son números enteros de 0 a 6 y m es un número entero de 1 a 6 en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de fórmula II-B.

5. Un inmunoensayo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que X es o en la que R3 es hidrógeno o tomado junto con su átomo de oxígeno unido forma un éster reactivo y R4 es oxígeno o azufre en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de fórmula II-B.

6. Un inmunoensayo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que X es

y R3 es hidrógeno en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de fórmula II-B.

7. Un inmunoensayo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que X es y R3 forma un éster reactivo en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de fórmula II-B.

8. Un inmunoensayo según la reivindicación 7, en el que el éster formado es un alquiléster inferior, imidoéster o amidoéster en el compuesto de fórmula II-A y/o el compuesto de fórmula II-B.

9. Un inmunoensayo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra es una muestra humana.

10. Un inmunoensayo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dicho anticuerpo se genera a partir de un inmunógeno que comprende un vehículo inmunogénico que contiene un polímero de poliamina conjugado con un compuesto de fórmula:

en la que X, Y y p son como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

11. Un inmunoensayo según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el anticuerpo está unido a un soporte sólido.

12. Un inmunoensayo según la reivindicación 11, en el que el soporte sólido son placas de microtitulación.

13. Un inmunoensayo según la reivindicación 11, en el que el soporte sólido son nanopartículas.

14. Un anticuerpo que se une selectivamente a 5-fluoro-uracilo y tiene una reactividad cruzada con cada uno de

uracilo, citosina y tegafur de no más del 12 %, siendo dicha reactividad cruzada relativa a su unión al 5-fluorouracilo.

15. Un anticuerpo según la reivindicación 14, en el que dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

16. Un anticuerpo según la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en el que dicho anticuerpo procede de ratones, conejos o ratas.

17. Un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en donde dicho anticuerpo se obtiene de un vehículo inmunogénico que contiene un polímero de poliamina conjugado con un compuesto de fórmula:

en la que X, Y y p son como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

18. Un kit para determinar la presencia de 5-fluoro-uracilo en una muestra de un paciente que comprende reactivos en recipientes separados, siendo uno de los reactivos un conjugado de un vehículo con un compuesto de fórmula:

en la que X, Y y p son como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, o un compuesto de fórmula:

en la que X, Y y p son como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8,

o una mezcla de los mismos; y el segundo recipiente que contiene un anticuerpo selectivamente reactivo con 5-fluorouracilo y que tiene una reactividad cruzada relativa al 5-fluoro-uracilo con cada uno de uracilo, citosina y tegafur de no más del 12 %.

19. Un kit según la reivindicación 18, en el que dicho conjugado está presente en una cantidad predeterminada en 15 dicho primer recipiente.

20. Un kit según la reivindicación 18 o la reivindicación 19, en el que dicho kit se usa para determinar la cantidad de 5-fluoro-uracilo en dicha muestra.

21. Un kit según una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en el que dicho anticuerpo se genera a partir de un inmunógeno de un polipéptido de poliamina inmunogénico ligado a un compuesto de fórmula:

en la que p, X e Y son como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.