Dispositivo microfluídico funcionalizado para inmunofluorescencia.

Un dispositivo microfluídico que comprende un portaobjetos y una parte en la que está presente al menos unaranura,

siendo dicha parte una almohadilla blanda de silicona, neopreno o polidimetilsiloxano (PDMS) y estandoacoplada de manera reversible al portaobjetos, siendo dicho portaobjetos y dicha parte tales que mediante su uniónse forma un microcanal, no extendiéndose dicho microcanal a lo largo de toda la longitud de la parte en la que estápresente y accediéndose al mismo desde la superficie superior del dispositivo a través de orificios de paso,caracterizado por que al menos la zona sobre la superficie de dicho portaobjetos orientada hacia dicho microcanalestá funcionalizada con una película de óxido de metal nanoestructurado hidrófilo y por que dicho óxido se trata conplasma para obtener un ángulo de contacto no superior a 10º.

Dispositivo microfluídico funcionalizado para inmunofluorescencia

Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere al campo de ensayos analíticos basados en fluorescencia y, en particular, a un dispositivo que puede usarse en ensayos de FISH. Así mismo, se abarca un método para realizar de manera eficiente dicho ensayo mediante el uso del dispositivo de la invención.

Técnica anterior

La microfluídica es una ciencia multidisciplinar reciente que trata de volúmenes de líquidos muy pequeños, desde microlitros hasta femtolitros. Su primera aplicación se refería a cabezales de impresión de chorro, pero ha demostrado ser adecuada para el desarrollo de tecnología de “laboratorio en-un-chip”, especialmente en el campo de la biotecnología, en la que las muestras se caracterizan por tamaños muy pequeños. La biología molecular, el análisis enzimático, el análisis genómico, la proteómica, la patología clínica, el diagnóstico, el análisis ambiental, etc. son todos ellos campos de posible aprovechamiento de la microfluídica. A tales dimensiones de microescala, los fluidos pueden mostrar un comportamiento muy diferente, en comparación con la macroescala, una característica que debe tenerse en cuenta cuando se diseñan dispositivos microfluídicos o experimentos que hacen uso de los mismos. Por ejemplo, la tensión superficial, la disipación de energía, la difusión y la resistencia fluídica, pueden influir enormemente en el resultado de los experimentos.

Por estos motivos, los protocolos ordinarios o habituales de estos ensayos no pueden usarse directamente en dispositivos microfluídicos, sino que, en cambio, deben diseñarse procedimientos especiales antes de su implementación.

Las ventajas relacionadas con el uso de la microfluídica se originan en el manejo más sencillo permitido por tales dispositivos, el mayor control del flujo permitido, el tiempo de análisis reducido, el alto control concedido tanto sobre la concentración como sobre las interacciones moleculares, el incomparable ahorro en costes para reactivos y productos de desecho, haciendo de este modo su uso más respetuoso con el medioambiente y proporcionando la capacidad de procesar más muestras con menos espacio debido a una reducida obstaculización de los instrumentos.

Las ventajas anteriores permiten que se automaticen experimentos que incluyen el uso de dispositivos microfluídicos, lo que sería muy interesante desde el punto de vista industrial.

La biotecnología de microchip, en particular, se está beneficiando al máximo de la microfluídica, gracias al nuevo flujo de trabajo integrado desarrollado.

Los dispositivos de laboratorio en-un-chip son chips de pocos milímetros cuadrados a pocos centímetros cuadrados sobre los que se reproducen los bioensayos a una escala mucho menor, en forma de circuitos microfluídicos.

Los dispositivos de laboratorio en-un-chip, o circuitos microfluídicos para su uso en dichos dispositivos, se describen ampliamente en la bibliografía.

La patente de los Estados unidos con Nº 6.613.560 divulga dispositivos miniaturizados para llevar a cabo procesos químicos y bioquímicos, en particular un microrreactor para llevar a cabo amplificación de ADN; este documento afronta el problema de una adsorción indeseada de la muestra bajo análisis por las paredes del microrreactor, y propone el uso de microrreactores hechos (o con superficies cubiertas) con materiales que muestran una adsorción reducida de los compuestos presentes en la muestra.

La solicitud de patente internacional WO 95/22051 divulga un dispositivo de célula de flujo que tiene, en sus 55 canales, unos reactivos inmovilizados que producen una respuesta eléctrica u ópticamente detectable frente a un analito que puede estar contenido en una muestra de ensayo. La solicitud de patente europea EP 1542010 divulga un dispositivo microfluídico que comprende una zona de reacción, diseñada para alojar una reacción entre al menos una especie presente en la muestra y al menos una sustancia específica, fijada en la zona, que puede provocar una interacción de manera específica o no específica con una o más sustancias predeterminadas (especies diana) . La fijación segura de la sustancia específica a las paredes del circuito microfluídico se obtiene por medio de una película intermedia, inmovilizada (formada generalmente por un compuesto orgánico) formada previamente sobre dichas paredes.

Los dispositivos de laboratorio en-un-chip se encuentran ya disponibles para su uso en una variedad de 65 técnicas analíticas, tales como electroforesis, cromatografía, tinción, citometría de fluorescencia, análisis de proteínas, reacción en cadena de la polimerasa, análisis de sangre, etc. y, como aplicación adicional, Hibridación In Situ con Fluorescencia (Fluorescence In Situ Hybridisation) (FISH) . Como referencia general con respecto a FISH, véase, por ejemplo, “Cytogenetic and FISH techniques in Myeloid Malignancies”, L. J. Campbell, Methods in Molecular Medicine, 2006, Vol. 125, páginas 13-26.

Más en detalle, FISH es una herramienta muy sensible usada en diagnóstico para la detección de alteraciones del genoma.

FISH representa una herramienta de diagnóstico muy prometedora para la identificación transposiciones o anomalías cromosómicas, que no pueden detectarse con otras técnicas convencionales. Por ejemplo, el análisis de alteraciones en los cromosomas puede ser predictivo de una enfermedad futura o de una respuesta a terapia.

Como primera etapa, FISH requiere la inmovilización celular sobre un soporte, tal como, por ejemplo, un portaobjetos de vidrio para microscopio; después de eso, las células experimentan una digestión de proteína con el fin de eliminar proteínas citoplasmáticas y cromosómicas, permitiendo de ese modo un “acceso” mejorado al ADN

cromosómico, que necesita desnaturalizarse, por ejemplo mediante incubación con soluciones a base de formaldehído. Después de la deshidratación celular con series de soluciones a base de etanol, se añaden sondas de ADN. La desnaturalización se realiza entonces a aproximadamente 75 ºC durante 2-5 min y se permite la incubación. Un tratamiento con una solución post-hibridación adecuada permite evitar uniones perturbadoras no específicas debidas a hibridación cruzada. Sitios de anomalía en la secuencia cromosómica se hacen de este modo evidentes mediante obtención de imágenes de fluorescencia.

Antes de FISH, el análisis de ADN hacía uso de métodos escasamente rentables, mientras que, hoy en día, FISH permite a los investigadores investigar rápidamente y entender la base de muchas enfermedades y cánceres.

Por ejemplo, FISH encuentra ya aplicación en pruebas de médula ósea para detectar tumores hematológicos, tales como leucemia, linfoma y mieloma, en pruebas de tumor sólido, ganglios linfáticos y sangre periférica, en diagnóstico genético preimplantacional, en cribados de anomalías genéticas prenatales y en postnatales.

Como ventaja general, FISH puede aplicarse directamente a muestras tumorales, tales como biopsias, secciones o material incrustado en parafina, proporcionando resolución hasta el nivel de células individuales, permitiendo la detección de acontecimientos raros en una muestra celular adecuada. A pesar de las posibles ventajas ofrecidas por esta técnica, su adopción práctica ha estado obstaculizada hasta el momento por varios inconvenientes.

En primer lugar, FISH es extremadamente cara, tanto en lo que se refiere a los costes de reactivos como al tiempo hombre y tiempo máquina necesarios para realizar el protocolo y el análisis de imagen. Este límite impide que FISH sea un método de cribado masivo.

Un enfoque adecuado para superar este límite sería el desarrollo de un protocolo miniaturizado aprovechando las características de los dispositivos microfluídicos.

Sin embargo, un límite adicional de protocolos y dispositivos de FISH que puede predecirse es la baja eficiencia de la adhesión celular en dispositivos microfluídicos; esto se debe al hecho de que, debido a las secciones 45 transversales muy limitadas de los canales microfluídicos, deben aplicarse presiones relativamente altas a las muestras de líquido, con el fin de hacer que éstas se muevan en el dispositivo, lo que, a su vez, lleva a velocidades de flujo relativamente altas. Por ejemplo, el artículo “FISH and chips: chromosomal analysis on microfluidic platforms”, V. J. Sieben y col., IET Nanobiotechnologies, 2007, 1 (3) páginas 27-35, describe un protocolo de adhesión convencional mediante citocentrifugación que, sin embargo, sólo obtiene un rendimiento de retención... [Seguir leyendo]

1. Un dispositivo microfluídico que comprende un portaobjetos y una parte en la que está presente al menos una ranura, siendo dicha parte una almohadilla blanda de silicona, neopreno o polidimetilsiloxano (PDMS) y estando 5 acoplada de manera reversible al portaobjetos, siendo dicho portaobjetos y dicha parte tales que mediante su unión se forma un microcanal, no extendiéndose dicho microcanal a lo largo de toda la longitud de la parte en la que está presente y accediéndose al mismo desde la superficie superior del dispositivo a través de orificios de paso, caracterizado por que al menos la zona sobre la superficie de dicho portaobjetos orientada hacia dicho microcanal está funcionalizada con una película de óxido de metal nanoestructurado hidrófilo y por que dicho óxido se trata con plasma para obtener un ángulo de contacto no superior a 10º.

2. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho óxido de metal nanoestructurado está constituido por nanopartículas con una distribución de tamaño que cubre el intervalo desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 50 nm y centrado dentro de 5 y 15 nm.

3. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho óxido se selecciona entre óxido de Ti, óxido de Zn u óxido de Zr.

4. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha película tiene un grosor 20 comprendido entre 20 nm y 200 nm.

5. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con la reivindicación 4, en el que dicha película tiene un grosor comprendido entre 40 nm y 60 nm y una rugosidad superficial comprendida entre 5 y 15 nm.

6. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el óxido de metal nanoestructurado tiene una estructura porosa con una densidad de masa de desde aproximadamente 1/2 hasta aproximadamente 1/10, de la densidad de masa del óxido a granel correspondiente.

7. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con la reivindicación 6, en el que el óxido es óxido de Ti con una densidad

de masa de aproximadamente 1/7 de la densidad de masa de TiO2 denso, banda prohibida óptica entre 3, 2 y 3, 6 eV e índice de refracción entre 1, 6 y 1, 8.

8. Un dispositivo microfluídico de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha película se deposita mediante técnica de PMCS. 35

9. Uso del dispositivo microfluídico de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores en un ensayo analítico basado en fluorescencia.

10. Uso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que dicho ensayo es un ensayo de FISH. 40

11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho ensayo de FISH se lleva a cabo de acuerdo con un protocolo que comprende las etapas de:

a) cargar una muestra celular en el microcanal del dispositivo microfluídico de las reivindicaciones 1 a 8;

b) dejar incubar las células; c) fijar las células con una solución de un alcohol y un ácido carboxílico débil; d) lavar con SSC; e) lavar con una solución de pepsina; f) fijar posteriormente con una solución de formaldehído;

g) añadir una serie de soluciones de etanol; h) añadir una solución de un agente desnaturalizante; i) repetir la etapa g) una vez; j) añadir la sonda marcada y dejar incubar; k) eliminar la parte que aloja el microcanal del portaobjetos;

l) lavar con una solución que comprende SSC y NP40, estando la muestra celular en forma de una suspensión celular.

12. Uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dicha suspensión celular es una suspensión de células no adherentes. 60

13. Uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que dichas células no adherentes son células vivas.

14. Uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que dichas células son células fijadas.