Semicuerpos: agentes terapéuticos activados por dimerización.

Un conjunto de inmunoglobulinas modificadas que comprende dos inmunoglobulinas complementarias quepueden formar un agente o agentes combinados funcionales con propiedades específicas después de la unión de laprimera y la segunda inmunoglobulinas complementarias a una célula objetivo;

en el que cada inmunoglobulinacomprende una primera, segunda y tercera porciones en las que:

(a) cada primera porción es un scFv u otro fragmento de unión a antígeno de una inmunoglobulina y la primeraporción de la primera inmunoglobulina complementaria puede interaccionar con un primer antígeno sobre la célulaobjetivo y la primera porción de la segunda inmunoglobulina complementaria puede interaccionar con un antígenodiferentes sobre dicha célula objetivo;

(b) cada segunda porción es un agente o una porción incompleta, no funcional de un agente, de forma que las dossegundas porciones son:

(i) moléculas indicadoras distintas que, en combinación, proporcionan una señal combinada,

(ii) porciones no funcionales complementarias de una única molécula indicadora, o

(iii) dominios Fc no funcionales, incompletos que puede formar un dominio Fc funcional; y

(c) cada tercera porción es un miembro diferente de un par de unión complementario que comprende un primer y unsegundo miembros en la que el par de unión comprende porciones complementarias de una cremallera de leucina,un par ligando-receptor, actina y una proteína de unión a actina o aptámeros de ADN;

en el que después de la unión de las inmunoglobulinas complementarias a los dos antígenos se combinan los paresde unión:

(i) permitiendo que las moléculas indicadoras proporcionen una señal combinada,

(ii) permitiendo que las porciones no funcionales complementarias de una única molécula indicadoras reconstituyanuna única molécula indicadora, o

(iii) permitiendo que los dominios Fc no funcionales incompletos formen un dominio Fc completo.

Semicuerpos: agentes terapéuticos activados por dimerización

Antecedentes de la invención Campo de la invención La presente invención se refiere de forma general a un conjunto de inmunoglobulinas modificadas que comprende dos inmunoglobulinas complementarias, que en el presente documento se denominan "semicuerpos" que son útiles para dirigirse a células en particular de un sujeto. Más en particular, la presente invención proporciona un conjunto de semicuerpos en el que es necesario que al menos dos moléculas del conjunto, cada una específica para un antígeno diferente sobre una célula objetivo, interaccionen entre sí en la superficie celular para formar un complejo activo que dirige la citotoxicidad celular mediada por semicuerpos o por el complemento y/o la función indicadora y/o la actividad terapéutica. Los semicuerpos de la presente invención son útiles para dirigirse a células en particular tales como células cancerosas, incluyendo células de leucemia, patógenos, incluyendo agentes de malaria, bacterianos y víricos, y células madre, incluyendo células madre embrionarias y adultas y células patógenas. Por lo tanto, la presente invención proporciona métodos de tratamiento, diagnóstico y realización de investigaciones y composiciones que comprenden semicuerpos útiles para los mismos.

Descripción de la técnica anterior

Al final de la descripción se recogen los datos bibliográficos de las publicaciones mencionadas por autor en la presente memoria descriptiva.

Las referencias a cualquier técnica anterior en la presente memoria descriptiva no son, y no deberían considerarse como, un reconocimiento o cualquier otra forma de sugerencia de que esta técnica anterior forma parte del conocimiento general en ningún país.

Una característica clave en la búsqueda y el desarrollo de agentes terapéuticos es la discriminación de objetivos o toxicidad selectiva. En particular, es de importancia capital la capacidad para distinguir células objetivo tales como células cancerosas o células infectadas con células patógenas entre una población de células sanas en un sujeto. Este es, en particular, el caso de los tratamientos contra el cáncer donde las células cancerosas objetivo tienen muchas propiedades fisiológicas, anatómicas y bioquímicas en común con las células sanas circundantes. Aunque algunos fármacos antineoplásicos provocan daños colaterales a células sanas, su uso puede estar indicado, o al menos justificado, para cánceres de crecimiento rápido, particularmente agresivos.

Los anticuerpos terapéuticos son el campo farmacéutico que está creciendo más rápido, con más de 30 anticuerpos en fases finales de ensayos clínicos (Hudson y Souriau, Nat Med 9:129-134, 2003) . Existen muchas variaciones de anticuerpos genomanipulados (por ejemplo, monoclonales de ratón, quiméricos, humanizados, monoclonales humanos, fragmentos de anticuerpo variables monocatenarios (scFv) , minicuerpos, aptámeros) . Los diacuerpos desarrollados usando tecnología de ADN recombinante, contienen dos o más fragmentos de anticuerpo variables monocatenarios (scFv) con especificidades de unión diferentes y una separación apropiada entre estos dominios para permitir que ambos scFv se unan a antígenos de forma simultánea (Hudson y Souriau, supra 2003) . Se han formado anticuerpos scFv bivalentes y biespecíficos usando casetes de dimerización a base de cremalleras de leucina unidos a diferentes scFv (de Kruif y Logtenberg, J Biol Chem 271:7630-7634, 1996) . Se han diseñado anticuerpos biespecíficos con diferentes dominios scFv conectados por una cadena polipeptídica para entrecruzar linfocitos T con tumores. Las dos o más interacciones que tienen estos anticuerpos quiméricos con diferentes antígenos de superficie sobre una célula aumentarían enormemente la fuerza de unión, dado que las constantes de disociación de las interacciones individuales se multiplican.

Aunque los anticuerpos terapéuticos son importantes, los anticuerpos multiespecíficos no han tenido tanto éxito. Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar fármacos y otros agentes terapéuticos a base de anticuerpos que sean más altamente selectivos para las células objetivo.

Se han propuesto anticuerpos completos como agentes dirigidos altamente específicos (Carter, Nature Reviews 1:118-128, 2001) . En una propuesta, se enlazan agentes citotóxicos a un anticuerpo específico para un antígeno sobre una célula objetivo. Sin embargo, aunque los anticuerpos tienen un alto grado de especificidad por el objetivo, no han alcanzado un uso terapéutico patológico extendido y se usan principalmente en aplicaciones clínicas de formación de imágenes. Esto puede ser debido a sus semividas en circulación relativamente largas y a sus funciones efectoras asociadas.

No obstante, los anticuerpos modificados han alcanzado cierto nivel de aceptación en aplicaciones inmunoterápicas (Carter (2001) supra; de Haard et al., Adv. Drug Deliver y Rev. 31:5-31, 1998; Chames y Baty, FEMS Microbiol. Lett. 189:1-8, 2000; Funaro et al., Biotechnol. Adv. 18:385-401, 2000; Hudson, Exp. Opin. Invest Drugs 9:1231-1242, 2000) .

En la tabla 1 de Carter (2001) supra, se revisan ejemplos que implican anticuerpos terapéuticos.

Todos estos anticuerpos contienen el dominio Fc que es necesario para la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) .

Ohiro et al. (Anal. Chem. 74:5786-5792, 2002) describen un inmunoensayo homogéneo y no competitivo basado en la transferencia de energía de resonancia por fluorescencia potenciada por la interacción con cremalleras de leucina.

Otro desarrollo útil en el uso de fragmentos de anticuerpo es su fusión con agentes activos tales como isótopos radioactivos (Wu et al., Immunotechnology 2:21-36, 1996; Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:8495-8500, 2000; Adams et al., Nuc. Med. Biol. 27:330-346, 2000) , enzimas para producir tratamiento (Bagshawe y Begent, Adv. Drug Deliver y Rev. 22:365-367, 1996) y toxinas para la destrucción dirigida de células (Reiter y Pastan, Tibtech 16:51520, 1998; Kreitman, Curr. Opin. Immunol. 11:570-578, 1999) .

Son anticuerpos modificados de particular interés los fragmentos variables monocatenarios (scFv) que llevan las secuencias de la región variable de las cadenas ligera y pesada unidas. Los fragmentos de anticuerpo scFv derivan de porciones de fragmento de unión a antígeno (Fab) de un anticuerpo que comprende la región V de una cadena pesada enlazada por un tramo de péptido sintético a una región V de una cadena ligera.

Aunque los fragmentos de anticuerpo scFv han alcanzado un nivel de utilidad razonable como moléculas dirigidas, carecen del dominio Fc y no pueden inducir ADCC o CDC.

La presente invención permite el uso de formas modificadas de fragmentos de anticuerpo scFv en tratamiento celular dirigido y/o diagnóstico y/o investigación.

Sumario de la invención A lo largo de la presente memoria descriptiva, a menos que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra “comprende”, o variaciones tales como “comprenden” o “comprendiendo”, implica la inclusión de un elemento o entero o grupo de elementos indicado pero no la exclusión de cualquier otro elemento o entero o grupo de elementos o enteros.

La presente invención proporciona un conjunto de inmunoglobulinas modificadas que comprende dos inmunoglobulinas complementarias que pueden formar un agente o agentes combinados funcionales con propiedades específicas después de la unión de la primera y la segunda inmunoglobulinas complementarias a una célula objetivo; en el que cada inmunoglobulina comprende una primera, segunda y tercera porciones en las que:

(a) cada primera porción es un scFv u otro fragmento de unión a antígeno de una inmunoglobulina y la primera porción de la primera inmunoglobulina complementaria puede interaccionar con un primer antígeno sobre la célula objetivo y la primera porción de la segunda inmunoglobulina complementaria puede interaccionar con un antígeno diferente sobre dicha célula objetivo;

(b) cada segunda porción es un agente o una porción incompleta, no funcional de un agente, de forma que las dos segundas porciones son:

(i) moléculas indicadoras distintas que, en combinación, proporcionan una señal combinada,

(ii) porciones no funcionales complementarias de una única molécula indicadora, o

(iii) dominios Fc no funcionales, incompletos que pueden formar un dominio Fc funcional; y

(c) cada tercera porción es un miembro diferente de un par de unión complementario que comprende un primer y un segundo miembros, en la... [Seguir leyendo]

1. Un conjunto de inmunoglobulinas modificadas que comprende dos inmunoglobulinas complementarias que pueden formar un agente o agentes combinados funcionales con propiedades específicas después de la unión de la primera y la segunda inmunoglobulinas complementarias a una célula objetivo; en el que cada inmunoglobulina comprende una primera, segunda y tercera porciones en las que:

(a) cada primera porción es un scFv u otro fragmento de unión a antígeno de una inmunoglobulina y la primera porción de la primera inmunoglobulina complementaria puede interaccionar con un primer antígeno sobre la célula objetivo y la primera porción de la segunda inmunoglobulina complementaria puede interaccionar con un antígeno diferentes sobre dicha célula objetivo;

(b) cada segunda porción es un agente o una porción incompleta, no funcional de un agente, de forma que las dos segundas porciones son:

(i) moléculas indicadoras distintas que, en combinación, proporcionan una señal combinada,

(ii) porciones no funcionales complementarias de una única molécula indicadora, o

(iii) dominios Fc no funcionales, incompletos que puede formar un dominio Fc funcional; y

(c) cada tercera porción es un miembro diferente de un par de unión complementario que comprende un primer y un segundo miembros en la que el par de unión comprende porciones complementarias de una cremallera de leucina, un par ligando-receptor, actina y una proteína de unión a actina o aptámeros de ADN;

en el que después de la unión de las inmunoglobulinas complementarias a los dos antígenos se combinan los pares de unión:

(i) permitiendo que las moléculas indicadoras proporcionen una señal combinada,

(ii) permitiendo que las porciones no funcionales complementarias de una única molécula indicadoras reconstituyan una única molécula indicadora, o

(iii) permitiendo que los dominios Fc no funcionales incompletos formen un dominio Fc completo.

2. El conjunto de inmunoglobulinas como se define en la reivindicación 1, en el que la primera porción es una estructura de afinidad seleccionada de dAb y nanocuerpos.

3. El conjunto de inmunoglobulinas como se define en la reivindicación 1 o 2 para su uso en tratamiento o para diagnóstico.

4. El conjunto de inmunoglobulinas como se define en la reivindicación 1 o 2, en el que la segunda porción de cada inmunoglobulina es un dominio Fc no funcional incompleto que puede formar un dominio Fc funcional para su uso en el tratamiento de cáncer o una infección induciendo una respuesta citotóxica sobre una célula objetivo en un sujeto, en el que dichas inmunoglobulinas complementarias se unes a dichos diferentes antígenos sobre la célula objetivo y después se unen entre sí en la superficie de la célula para formar un dominio Fc activo a través del cual se media la ADCC o la CDC.

5. El conjunto de inmunoglobulinas como se define en la reivindicación 1 o 2 para su uso en el diagnóstico del cáncer, en el que dichas primeras porciones pueden interaccionar diferentes antígenos específicos de cáncer sobre la célula y dichas segundas porciones comprenden distintas moléculas indicadoras o porciones no funcionales complementarias de una única molécula indicadora, en el que después de la unión de las inmunoglobulinas individuales a los diferentes antígenos, los pares de unión se combinan en la superficie celular permitiendo que las moléculas indicadoras proporcionen una señal combinada o reconstituyan una única molécula indicadora.

6. El conjunto de inmunoglobulinas para su uso en el diagnóstico del cáncer de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la molécula o moléculas indicadora (s) es/son colorantes fluorescentes.

7. Uso de las inmunoglobulinas como se definen en la reivindicación 1 o 2 para preparar un agente medicinal, de diagnóstico o de afinidad.

8. El conjunto de inmunoglobulinas para su uso en el tratamiento del cáncer o una infección de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el sujeto es un ser humano, primate, animal de cría, animal de laboratorio, animal salvaje en cautiverio o especie aviar.

9. El conjunto de inmunoglobulinas o el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que cada

inmunoglobulina es específica para un antígeno CD.

10. Un conjunto de inmunoglobulinas como se reivindica en la reivindicación 1, en el que cada conjunto comprende al menos dos inmunoglobulinas, teniendo cada una la estructura:

x - (FcI) i – scFv (Ag1) ;

ó

y - (FcII) i – scFv (Ag2) ;

en la que:

x e y son compañeros de unión que pueden formar una asociación o unirse entre sí en la que los pares de unión comprenden porciones complementarias de una cremallera de leucina, un par receptor-ligando, actina y una proteína de unión a actina o aptámeros de ADN;

(FcI) i y (FcII) i con cada uno dominio Fc incompletos, no funcionales que pueden formar un dominio Fc funcional después de la unión de x e y; y

scFv (Ag1) y scFv (Ag2) son fragmentos variables monocatenarios que tienen especificidad por dos antígenos (Ag) diferentes, Ag1 o Ag2 sobre la célula objetivo.

11. Un conjunto de inmunoglobulinas como se reivindica en la reivindicación 1, en el que cada conjunto comprende al menos dos inmunoglobulinas, teniendo cada una la estructura:

x - (MoI) i – scFv (Ag1) ;

ó

y - (MoII) i – scFv (Ag2) ;

en la que:

x e y son compañeros de unión que pueden formar una asociación o unirse entre sí en la que los pares de unión comprenden porciones complementarias de una cremallera de leucina, un par receptor-ligando, actina y una proteína de unión a actina o aptámeros de ADN;

(MoI) i y (MoII) i son cada uno porciones de una molécula indicadora que puede formar un indicador funcional después de la unión de x e y; y

scFv (Ag1) y scFv (Ag2) son fragmentos variables monocatenarios que tienen especificidad por dos antígenos (Ag) diferentes, Ag1 o Ag2 sobre la célula objetivo.

12. Un método in vitro para identificar selectivamente una célula, comprendiendo dicho método poner en contacto dicha célula con un conjunto de inmunoglobulinas como se define en la reivindicación 1 o 2, en el que dichas primeras porciones pueden interaccionar diferentes antígenos sobre la célula, dichas segundas porciones comprenden distintas moléculas indicadoras o porciones complementarias no funcionales de una única molécula indicadora y dichas terceras porciones son pares de unión complementarios, en el que después de la unión de las inmunoglobulinas individuales a los diferentes antígenos, los pares de unión se combinan en la superficie celular permitiendo que las moléculas indicadoras proporcionen una señal combinada o reconstituyan una única molécula indicadora.

13. El método de la reivindicación 12, en el que la molécula o moléculas indicadora (s) es/son colorantes fluorescentes.

14. El método de la reivindicación 12 o 13, en el que la célula es una célula cancerosa o una célula madre.

15. El método de la reivindicación 12 o 13 para identificar células cancerosas en un sujeto, comprendiendo dicho método poner en contacto células supuestamente cancerosas con un conjunto de inmunoglobulinas como se define en la reivindicación 1 o 2, en el que dichas primeras porciones de dichas inmunoglobulinas pueden interaccionar con diferentes antígenos específicos de cáncer sobre la célula.

16. Un método para detectar una célula objetivo, comprendiendo dicho método poner en contacto una muestra que, supuestamente, comprende dicha célula objetivo con un conjunto de inmunoglobulinas como se define en la reivindicación 1 o 2, en el que dichas primeras porciones pueden interaccionar diferentes antígenos sobre dicha

célula, dichas segundas porciones comprenden distintas moléculas indicadoras o porciones no funcionales complementarias de una única molécula indicadora, en el que después de la unión de las inmunoglobulinas individuales a los diferentes antígenos, los pares de unión se combinan en la superficie celular permitiendo que las moléculas indicadoras proporcionen una señal combinada o reconstituyan una única molécula indicadora.

17. El método de la reivindicación 16, en el que la molécula o moléculas indicadora (s) es/son colorantes fluorescentes.

18. El método de la reivindicación 16 o 17, en el que el antígeno objetivo es una proteína.

19. El método de la reivindicación 18, en el que dicha proteína es una proteína con modificación postraduccional.

20. El método de la reivindicación 19, en el que dicha proteína es una proteína fosforilada o glucosilada.

21. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20, en el que la muestra se ha retirado de un sujeto.

22. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, en el que el sujeto es un ser humano.

23. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, en el que la célula objetivo es indicativa de una enfermedad o afección.

24. El conjunto de inmunoglobulinas como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 9, 10 o 11 para su uso en el tratamiento del cáncer.

25. El conjunto de inmunoglobulinas o su uso como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el par de unión es un par receptor-ligando que comprende una citocina y un receptor de citocina.