PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACION DE UN LIGANDO CAPAZ DE MODULAR SELECTIVAMENTE UNA CASCADA FUNCIONAL QUE IMPLICA UNA DIANA, Y SUS APLICACIONES PARA EL CRIBADO DE ALTO CAUDAL DE MOLECULAS DE INTERES.

Procedimiento de identificación de un ligando capaz de modular selectivamente una cascada funcional que implica una diana de una célula de un organismo humano,

animal o vegetal o de un microorganismo, implicando dicha cascada funcional una sucesión de reacciones en dicha célula, siendo cada una de las reacciones dependiente de las anteriores y desembocando en una actividad biológica medible en dicha célula, que comprende por lo menos las etapas siguientes: a) identificar un anticuerpo intracelular o un fragmento de anticuerpo intracelular, que puede ser expresado en dicha célula y que comprende por lo menos uno de los dominios variables de una cadena de inmunoglobulina, capaz de unirse a dicha diana y modular dicha cascada funcional que implica dicha diana, b) cribar a partir de un banco de moléculas de masa molecular inferior a

La presente invención se refiere a un procedimiento de identificación de un ligando capaz de modular selectivamente una cascada funcional que implica una molécula diana o diana, así como a sus aplicaciones para el cribado de alto caudal de moléculas de interés, en particular terapéutico (medicamento).

Los adelantos recientes en el campo de la genómica y de la proteómica, que han conducido a la identificación de un número considerable de nuevas dianas terapéuticas potenciales, han abierto unas perspectivas muy interesantes en el campo farmacéutico.

Sin embargo, el descubrimiento de nuevos medicamentos implica poner a punto unos métodos de cribado de alto caudal de bancos de moléculas que sean eficaces, es decir, que permitan aislar a partir de un número restringido de moléculas seleccionadas (dianas o hits), unas moléculas activas in vivo sobre la patología que se desea tratar (líderes o leads).

En efecto, los ensayos funcionales (in vitro en cultivo celular o in vivo en un modelo animal apropiado) que permiten verificar la actividad de las dianas seleccionadas durante el cribado generalmente no se pueden adaptar al alto caudal.

Siendo la mayoría de las proteínas eucariotas multi-funcionales y estando implicadas en varias cascadas funcionales, las moléculas aisladas deben ser capaces de modular específicamente la propiedad de interés de la diana sin afectar a sus demás actividades cuya modulación podría tener unos efectos deletéreos para la célula.

En consecuencia, el cribado debe ser muy específico para restringir al máximo el número de dianas (hits) identificadas, de manera que se ensaye sólo un bajo número en unos ensayos funcionales in vivo.

Estos métodos de cribado deben además ser fáciles de realizar y aplicables a cualquier diana.

Con este objetivo, se han propuesto unos métodos de cribado que se basan en la identificación de moléculas (mimotopos) que imitan la interacción entre la diana y un péptido o un oligonucleótido (aptámero).

A título de ejemplo, la solicitud WO 03/059943 describe la identificación de péptidos que se unen a unas proteínas quinasas y que se pueden utilizar para el cribado de bancos de moléculas en unos ensayos competitivos. La solicitud WO 01/01137 se refiere a unas proteínas de fusión utilizadas para el estudio de las interacciones proteína-proteína, en las que se sustituye un dominio de unión modular de una primera proteína por un anticuerpo de cadena simple (sFv) y se sustituye el sitio de unión para un dominio de unión modular sobre una segunda proteína por un epítopo que se une a este anticuerpo scFv. La solicitud WO 2004/020619 se refiere en particular al uso de anticuerpos dirigidos contra unos mutantes de la proteína PLC-gamma2 en unos modelos animales para el estudio de las disfunciones relacionadas con la proteína PLC-gamma2. Por último, la solicitud WO 96/04557 describe la utilización de anticuerpos recombinantes para

identificar las superficies activas de dianas farmacéuticas.

Los métodos de cribado que utilizan unos aptámeros y/o unos péptidos se ilustran en Lapan et al., Expert Opin. Ther. Targets, 2002, 6, 507-516; Green et al., BioTechniques, 2001, 30, 1094-1110; Burgstaller et al., Drug Discovery Today, 2002, 7, 1221-1228; solicitudes internacionales PCT WO 98/19162 y WO 03/059943 y patente US nº 6.329.145.

En un primer tiempo, unos aptámeros/péptidos capaces de unirse a la diana son seleccionados in vitro y después se verifica su actividad moduladora, frente a la diana, mediante un ensayo funcional in vitro en un sistema celular apropiado o in vivo en un modelo animal apropiado.

En un segundo tiempo, los aptámeros/péptidos que poseen una actividad moduladora sobre la diana se utilizan en unos ensayos de unión competitiva para identificar unas dianas (hits) capaces de desplazar la unión existente entre el aptámero/péptido y la diana. A continuación, la actividad moduladora de las dianas frente a la diana se verifica mediante un ensayo funcional in vitro en cultivo celular o in vivo en un modelo animal apropiado, de manera que se aíslan unas moléculas “líderes” (leads).

Estos métodos han sido validados con unas dianas tales como la isoforma BB del factor de crecimiento humano derivado de las plaquetas (PDGF BB) y la proteína Rev del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).

Los inventores se han propuesto como objetivo la puesta a punto de métodos de cribado alternativos. Han demostrado que la sustitución de los aptámeros o de los péptidos moduladores por unos anticuerpos o unos fragmentos de anticuerpos moduladores, en los métodos de cribado tales como los descritos en la técnica anterior, permitía identificar unas moléculas capaces de modular selectivamente una cascada funcional que implica una diana (cascada metabólica, cascada de activación, cascada de señalización, etc.).

Los anticuerpos presentan la ventaja de reconocer cualquier región de una proteína, de manera específica y con una afinidad elevada (del orden del nM). En particular, pueden reconocer los sitios de superficie de esta proteína y son por lo tanto muy interesantes para inhibir específicamente las regiones de proteínas implicadas en unas cascadas funcionales a través de unas interacciones proteína-proteína; se ha demostrado en particular que unos fragmentos de anticuerpo (scFv) dirigidos contra los dominios SH2 de la proteína tirosinaquinasa Syk, eran capaces de inhibir específicamente in vivo la vía de la fosfolipasa C-γ2 (PLC-γ2; Dauvililiers et al., J. Immunol., 2002, 169, 2274-2283). En consecuencia, los mimotopos aislados mediante un procedimiento de cribado que utiliza unos anticuerpos o unos fragmentos de anticuerpos deberían presentar las mismas propiedades, en particular en términos de afinidad/especificidad para la diana.

Por ejemplo, los inventores han cribado un banco de 3.000 moléculas con la ayuda de un anticuerpo dirigido contra los dominios SH2 de la proteína tirosinaquinasa Syk y capaz de inhibir la vía de la PLC-γ2; entre los 10 ligandos de la proteína Syk que se seleccionaron, uno por lo menos era una molécula inhibidora in vivo, que actúa sobre la vía de la PLC-γ2, sin alterar la de Ras dependiente asimismo de la proteína Syk.

Por el contrario, no se ha demostrado que unos aptámeros y unos péptidos eran capaces de reconocer cualquier epítopo en la superficie de un antígeno. Debido a su pequeño tamaño, los péptidos y los aptámeros están más adaptados para interactuar en las cavidades de las dianas más que en superficie, lo cual es favorable para la inhibición de una actividad enzimática, pero poco interesante para inhibir unas cascadas funcionales.

Por otro lado, un cierto número de anticuerpos monoclonales recombinantes se utilizan en los tratamientos terapéuticos. Se pueden citar, por ejemplo, el cetuximab (anti-EGFR), el rituximab (anti-CD20), el infliximab (anti-TNF), etc. Estos anticuerpos son, o bien unos anticuerpos quiméricos, lo más frecuentemente ratón/humano, o bien unos anticuerpos humanizados. Estos anticuerpos son difíciles de producir y presentan un coste elevado. El procedimiento de cribado propuesto por los inventores permite sustituir estos anticuerpos por unas moléculas químicas que tienen las mismas propiedades inhibidoras, más fáciles de producir a un coste bastante más inferior (de por lo menos un factor 10).

La presente invención tiene por consiguiente por objeto, un procedimiento de identificación de un ligando capaz de modular selectivamente una cascada funcional que implica una diana de una célula de un organismo humano, animal o vegetal o de un microorganismo, implicando dicha cascada funcional una sucesión de reacciones en dicha célula, siendo cada una de las reacciones dependiente de las anteriores y en una actividad biológica medible en dicha célula, caracterizado porque comprende por lo menos las etapas siguientes:

a) identificar un anticuerpo intracelular o un fragmento de anticuerpo intracelular, que puede ser expresado en dicha célula y que comprende por lo menos uno de los dominios variables de una cadena de inmunoglobulina, capaz de unirse a dicha diana y modular dicha cascada funcional que implica dicha diana,

b) cribar a partir de un banco de moléculas de masa molecular inferior a 2.500 Da distintas de unos oligómeros, cíclicos o no cíclicos, los ligandos moduladores de la unión entre dicha diana y el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo identificado...

Reivindicaciones

1. Procedimiento de identificación de un ligando capaz de modular selectivamente una cascada funcional que implica una diana de una célula de un organismo humano, animal o vegetal o de un microorganismo, implicando dicha cascada funcional una sucesión de reacciones en dicha célula, siendo cada una de las reacciones dependiente de las anteriores y desembocando en una actividad biológica medible en dicha célula, que comprende por lo menos las etapas siguientes:

a) identificar un anticuerpo intracelular o un fragmento de anticuerpo intracelular, que puede ser expresado en dicha célula y que comprende por lo menos uno de los dominios variables de una cadena de inmunoglobulina, capaz de unirse a dicha diana y modular dicha cascada funcional que implica dicha diana,

b) cribar a partir de un banco de moléculas de masa molecular inferior a 2.500 Da diferentes de unos oligómeros, cíclicos o no cíclicos, unos ligandos moduladores de la unión entre dicha diana y el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo identificado en a), y

c) identificar a partir de los ligandos moduladores obtenidos en b), aquéllos capaces de modular dicha cascada funcional.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque las etapas a) y b) se llevan a cabo con la ayuda de una diana o de un derivado de la diana tal como un fragmento que comprende por lo menos el sitio de interés, un mimotopo, o también un anticuerpo anti-idiotípico que representa la imagen interna de dicho sitio de interés de la diana.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque dicha diana o su derivado o también el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo están marcados mediante cualquier medio que permite la obtención de una señal medible.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la identificación de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo en a) se lleva a cabo mediante el cribado de un banco de fragmentos scFv, preferentemente, un banco de fagos que expresa unos fragmentos scFv en su superficie.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque la identificación de dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo intracelular en a) comprende:

(i) una primera etapa de cribado de los anticuerpos o de los fragmentos de anticuerpos intracelulares capaces de unirse a dicha diana, y

(ii) una segunda etapa de identificación de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos intracelulares capaces de modular dicha cascada funcional, en unas células modificadas por un vector de expresión de dichos anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la etapa b) de cribado comprende:

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la etapa b) de cribado comprende: - la puesta en contacto del banco de moléculas a ensayar con la diana o uno de sus derivados tales como se han definido en la reivindicación 2, - la adición del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo, eventualmente marcado, y - la medición, mediante cualquier anticuerpo unido a la diana, en moléculas. medio apropiado, de la cantidad relativa de presencia o en ausencia de dicho banco de

- la puesta en contacto del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo, eventualmente marcado, con la diana o uno de sus derivados tales como se han definido en la reivindicación 2,

- la adición del banco de moléculas a ensayar de manera que se detectan las moléculas capaces de desplazar el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo de su complejo con el fragmento de la diana, y

- la medición, mediante cualquier medio apropiado, de la cantidad relativa de anticuerpo unido a la diana, en presencia o en ausencia de dicho banco de moléculas.

8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la etapa b) de cribado comprende:

- la mezcla del anticuerpo o del fragmento de anticuerpo, eventualmente marcado, con el banco de moléculas a ensayar,

- la puesta en contacto de la mezcla con la diana o uno de sus derivados tales como se han definido en la reivindicación 2, y

- la medición, mediante cualquier medio apropiado, de la cantidad relativa de anticuerpo unido a la diana, en presencia o en ausencia de dicho banco de moléculas.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque las etapas a) y c) se llevan a cabo mediante un ensayo funcional que permite medir la actividad biológica que resulta de dicha cascada funcional, en particular mediante un ensayo in vitro, en un sistema celular apropiado, o in vivo en un organismo no humano apropiado.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque dicha diana se selecciona de entre el grupo constituido por: una enzima, un receptor, una proteína adaptadora, un vehículo, una proteína de protección y una proteína reguladora.

11. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo identificado en a) está dirigido contra los dominios SH2 de la proteína Syk y es capaz de inhibir específicamente la vía de la PLCγ-2.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque dichas pequeñas moléculas orgánicas distintas de oligómeros tienen una masa molecular inferior a 1.000 Da.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque dichas pequeñas moléculas orgánicas distintas de los oligómeros tienen una masa molecular inferior a 750 Da.

14. Procedimiento según la reivindicación 4 ó 5, caracterizado porque dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo intracelular es capaz de unir la diana en el compartimento de las células modificadas en el que se expresa.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque dicha célula es una célula eucariota y más particularmente una célula de mamífero.

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque la diana es una molécula de un organismo humano, animal o vegetal.

17. Kit para la realización del procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque comprende por lo menos:

- una diana de una célula de un organismo humano, animal o vegetal o de un microorganismo, implicada en una cascada funcional que implica un sucesión de reacciones en dicha célula, siendo cada una de las reacciones dependiente de las anteriores y desembocando en una actividad biológica medible en dicha célula,