VARIANTES DE VHC.

Un polinucleótido que comprende una secuencia del VHC no natural que es capaz de replicación productiva en una célula huésped,

o es capaz de ser transcrito en una secuencia de VHC no natural, que es capaz de replicación productiva en una célula huésped, en el que la secuencia del VHC comprende, de 5' a 3' en el ácido nucleico de sentido positivo, una región funcional 5' no traducida (5' NTR); una o más regiones que codifican proteínas, incluyendo al menos una región que codifica la poliproteína que es capaz de replicar el ARN del VHC; y una región funcional 3' no traducida del VHC (3' NTR); en el que la región que codifica la poliproteína comprende un gen de NS5A que comprende una mutación adaptativa (i) que codifica un cambio en la secuencia de aminoácidos, seleccionado del grupo que consiste en Ser (1179) en Ile, Arg (1164) en Gly, Ala (1174) en Ser, Ser (1172) en Cys, Ser (1172) en Pro, de la SEQ ID NO: 3, o (ii) que comprende una eliminación de nucleótidos que corresponde a los nucleótidos de 5345 a 5485 de la SEQ ID NO: 6

Variantes de VHC

(1) Campo de la invención.

La invención se refiere a materiales y a metodologías relacionadas con la producción y el uso de variantes del virus de la hepatitis C (VHC) . Más específicamente, se proporcionan variantes del VHC que son útiles para el diagnóstico, terapia, vacunas y otros usos.

(2) Descripción de la técnica relacionada Breve visión general del virus de la hepatitis C

Después del desarrollo de ensayos de diagnóstico para el virus de la hepatitis A y hepatitis B, se reconoció un agente adicional, que podía ser transmitido experimentalmente a chimpancés [Alter y col., Lancet 1.459-463 (1978) ; Hollinger y col., Intervirology 10, 60-68 (1978) ; Tabor y col., Lancet 1, 463-466 (1978) ], como la causa principal de la hepatitis adquirida por transfusión. En 1989 se describieron los clones de ADNc correspondientes al agente de la hepatitis no A, no B (NANB) causante, llamado virus de la hepatitis C (VHC) [Choo y col., Science 244, 359-362 (1989) ]. Este descubrimiento ha llevado a rápidos avances en el diagnóstico, y a la comprensión de la epidemiología, patogénesis y virología molecular del VHC (para una revisión, Véase Houghton y col., Curr. Stud. Hematol. Blood Transfus. 61, 1-11 (1994) ; Houghton (1996) , pág. 1035-1058 en FIELDS VIROLOGY, Fields y col., Eds., Raven Press, Philadelphia; Major y col., Hepatology 25, 1527-1538 (1997) ; Reed y Rice, pág. 1-37 en HEPATITIS C VIRUS, Reesink, Ed., Karger, Basel; Hagedorn y Rice (1999) , THE HEPATITIS C VIRUSES, Springer, Berlín) . Se encuentran pruebas de la infección por el VHC en todo el mundo, y la prevalencia de los anticuerpos específicos para el VHC está en el intervalo desde 0, 4-2% en la mayoría de los países a más de 14% en Egipto [Hibbs y col., J. Inf. Dis. 168, 789-790 (1993) ]. Además de la transmisión por la sangre o los productos sanguíneos, o las vías sexual y congénita menos frecuentes, se producen casos esporádicos no asociadas a factores de riesgo conocidos y que dan cuenta de más de 40% de los casos de infección por el VHC [Alter y col., J. Am. Med. Assoc. 264, 2231-2235 (1990) ; Mast y Alter, Semin. Virol. 4, 273-283 (1993) ]. Las infecciones normalmente son crónicas [Alter y col., N. Eng. J. Med. 327, 1899-1905 (1992) ] y el desenlace clínico va desde un estado de vehículo no visible hasta la hepatitis aguda, hepatitis activa crónica y cirrosis, que está muy asociada al desarrollo del carcinoma hepatocelular.

Aunque se ha mostrado que el interferón (IFN) -α es útil para el tratamiento de una minoría de pacientes con 35 infecciones crónicas por el VHC [Davis y col., N. Engl. J. Med. 321, 1501 -1506 (1989) ; DiBisceglie y col., New Engl.

J. Med. 321, 1506-1510 (1989) ] y las vacunas de subunidades parecen prometedoras en el modelo de chimpancé [Choo y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 1294-1298 (1994) ], son necesarios más esfuerzos para desarrollar terapias y vacunas más eficaces (véase, p. ej., Tsambiras y col., 1999, Hepatitis C: Hope on the Horizon, Hepatitis C Symposium of 37th Annual Meeting of the Infectious Diseases Society of America, revisado en 40 http://www.medscape.com/medscape/cno/1999/IDSA/Stor y .cfm?stor y _id=913) . La considerable diversidad observada entre los diferentes aislados del VHC [para una revisión, Véase Bukh y col., Sem. Liver Dis. 15, 41-63 (1995) ; Fanning y col., 2000, Medscape Gastroenterology 2:mgi6558.fann], el surgimiento de variantes genéticas en individuos con infección crónica [Enomoto y col., J. Hepatol. 17, 415-416 (1993) ; Hijikata y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 175, 220-228 (1991) ; Katoy col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 189, 119-127 (1992) ; Kato y col., J.

45 Virol. 67, 3923-3930 (1993) ; Kurosaki y col., Hepatology 18, 1293-1299 (1993) ; Lesniewski y col., J. Med. Virol. 40, 150-156 (1993) ; Ogata y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3392-3396 (1991) ; Weiner y col., Virology 180, 842-848 (1991) ; Weiner y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3468-3472 (1992) ], y la falta de inmunidad protectora provocada después de infección por el VHC [Farci y col., Science 258, 135-140 (1992) ; Prince y col., J. Infect. Dis. 165, 438-443 (1992) ] son los retos principales hacia estos objetivos.

50 Biología molecular del VHC

Clasificación. Basándose en su estructura genómica y las propiedades de virión, el VHC se ha clasificado como un género separado en la familia flavivirus, que incluye otros dos géneros: los flavivirus (p. ej., virus de la fiebre amarilla 55 (YF) ) y los pestivirus animales (p. ej., el virus de la diarrea vírica bovina (BVDV) y el virus de la fiebre porcina clásica (CSFV) ) [Francki y col., Arch. Virol. Suppl. 2, 223 (1991) ]. Todos los miembros de esta familia tienen viriones con envuelta que contienen un genoma de ARN de cadena positiva que codifica todas las proteínas de virus específicas conocidas por traducción de un solo marco de lectura abierto (ORF) extenso.

Estructura y propiedades físicas del virión. Los estudios sobre la estructura y las propiedades físicas del virión del VHC se han visto dificultados por la falta de un sistema de cultivo celular que pudiera soportar la replicación vírica 5 eficiente y por los títulos normalmente bajos de virus infecciosos presentes en el suero. El tamaño del virus infeccioso, basándose en experimentos de filtración, es entre 30-80 nm [Bradley y col., Gastroenterology 88, 773779 (1985) ; He y col., J. Infect. Dis. 156, 636-640 (1987) ; Yuasa y col., J. Gen. Virol. 72, 2021-2024 (1991) ]. Las mediciones iniciales de densidad de flotación del material infeccioso en sacarosa dieron un intervalo de valores, con la mayoría presente en una mezcla de densidad baja < 1, 1 g/ml [Bradley y col., J. Med. Virol. 34, 206-208 (1991) ]. 10 Estudios posteriores han usado la RT/PCR para detectar el ARN específico del VHC como una medición indirecta del virus potencialmente infeccioso presente en el suero de seres humanos con infección crónica o chimpancés infectados experimentalmente. A partir de estos estudios, ha estado cada vez más claro que existe una heterogeneidad considerable entre las diferentes muestras clínicas, y que muchos factores pueden afectar al comportamiento de las partículas que contienen ARN de VHC [Hijikata y col., J. Virol. 67, 1953-1958 (1993) ; 15 Thomssen y col., Med. Microbiol. Immunol. 181, 293-300 (1992) ]. Dichos factores incluyen la asociación con inmunoglobulinas [Hijikata y col., (1993) Véase antes] o lipoproteínas de baja densidad [Thomssen y col., 1992, Véase antes, Thomssen y col., Med. Microbiol. Immunol. 182, 329-334 (1993) ]. En el suero de chimpancé en fase aguda muy infecciosa, el ARN específico del VHC normalmente se detecta en fracciones de densidad flotante baja (1, 03-1, 1 g/ml) [Carrick y col., J. Virol. Meth. 39, 279-289 (1992) ; Hijikata y col., (1993) Véase antes]. En otras 20 muestras, la presencia de anticuerpos contra el VHC y la formación de complejos inmunitarios se correlaciona con partículas de mayor densidad y menor infectividad [Hijikata y col., (1993) Véase antes]. El tratamiento de las partículas con cloroformo, que destruye la infectividad [Bradley y col., J. Infect. Dis. 148, 254-265 (1983) ; Feinstone y col., Infect. Immun. 41, 816-821 (1983) ], o con detergentes no iónicos, produjo partículas de mayor densidad que contenían ARN (1, 17-1, 25 g/ml) que se creyó que representaban nucleocápsidas del VHC [Hijikata y col., (1993)

Véase antes, Kanto y col., Hepatology 19, 296-302 (1994) ; Miyamoto y col., J. Gen Virol. 73, 715-718 (1992) ].

Ha habido descripciones de ARN específicos del VHC de sentido negativo en sueros y plasmas [véase, Fong y col., Journal of Clinical Investigation 88:1058-60 (1991) ]. Sin embargo, no parece probable que dichos ARN sean componentes esenciales de las partículas infecciosas, puesto que algunos sueros con infectividad alta pueden tener niveles bajos o indetectables de ARN de cadena negativa [Shimizu y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6037-6041 (1993) ].

La composición proteínica del virión no se ha determinado rigurosamente, pero las proteínas estructurales del VHC incluyen una proteína C básica y dos glicoproteínas de membrana, E1 y E2.

Replicación del VHC. Los primeros sucesos en la replicación del VHC se entienden poco. Un receptor de hepatocito puede ser CD81, que se une a la glicoproteína de la envuelta E2 (Peleri y col., 1998, Science 282:938-41) . La asociación de algunas partículas de VHC con beta-lipoproteínas e inmunoglobulinas aumenta la posibilidad de que estas moléculas huésped puedan modular la absorción de virus... [Seguir leyendo]

1. Un polinucleótido que comprende una secuencia del VHC no natural que es capaz de replicación productiva en una célula huésped, o es capaz de ser transcrito en una secuencia de VHC no natural, que es capaz de replicación productiva en una célula huésped, en el que la secuencia del VHC comprende, de 5' a 3' en el ácido nucleico de sentido positivo, una región funcional 5' no traducida (5' NTR) ; una o más regiones que codifican proteínas, incluyendo al menos una región que codifica la poliproteína que es capaz de replicar el ARN del VHC; y una región funcional 3' no traducida del VHC (3' NTR) ; en el que la región que codifica la poliproteína comprende un gen de NS5A que comprende una mutación adaptativa (i) que codifica un cambio en la secuencia de aminoácidos, seleccionado del grupo que consiste en Ser (1179) en Ile, Arg (1164) en Gly, Ala (1174) en Ser, Ser (1172) en Cys, Ser (1172) en Pro, de la SEQ ID NO: 3, o (ii) que comprende una eliminación de nucleótidos que corresponde a los nucleótidos de 5345 a 5485 de la SEQ ID NO: 6.

2. El polinucleótido de la reivindicación 1, que tiene una eficacia de transfección en células de mamífero mayor que 0, 01%.

3. El polinucleótido de la reivindicación 1, que tiene una eficacia de transfección en células de mamífero mayor que 0, 1%.

4. El polinucleótido de la reivindicación 1, que tiene una eficacia de transfección en células de mamífero mayor que 1%.

5. El polinucleótido de la reivindicación 1, que tiene una eficacia de transfección en células de mamífero de aproximadamente 6%.

6. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido es capaz de replicación en una célula no hepática.

7. El polinucleótido de la reivindicación 6, en el que la célula no hepática es una célula HeLa.

8. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que el VHC está deteriorado en su capacidad para producir enfermedad, establecer infecciones crónicas, producir respuestas autoinmunitarias y transformar células.

9. El polinucleótido de la reivindicación 1, en el que el polinucleótido comprende al menos un IRES seleccionado del grupo que consiste en un IRES vírico, un IRES celular y un IRES artificial.

10. El polinucleótido de la reivindicación 9, en el que la región que codifica la poliproteína del VHC codifica todas las proteínas estructurales y no estructurales del VHC.

11. El polinucleótido de la reivindicación 9, en el que la región que codifica la poliproteína no es capaz de hacer partículas de VHC infecciosas.

12. El polinucleótido de la reivindicación 11, en el que la región que codifica la poliproteína comprende una mutación y/o eliminación en la región que codifica las proteínas estructurales.

13. El polinucleótido de la reivindicación 10 o la reivindicación 12, que además comprende un gen exógeno operativamente unido a un primer IRES y la región que codifica la poliproteína del VHC operativamente unida a un segundo IRES.

14. El polinucleótido de la reivindicación 13, en el que el gen exógeno es un gen que codifica un marcador seleccionable o un gen indicador.

15. El polinucleótido de la reivindicación 14, en el que:

(a) el primer IRES es un IRES del VHC;

(b) el gen exógeno es un gen neo; y

(c) el segundo IRES es un IRES de EMCV.

16. El polinucleótido de la reivindicación 15, en el que la secuencia del VHC es una secuencia del VHC del genotipo 1.

17. El polinucleótido de la reivindicación 16, en el que la secuencia del VHC es del subtipo 1b.

18. El polinucleótido de la reivindicación 15, que comprende la SEQ ID NO: 5 o la SEQ ID NO: 6.

19. El polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que el polinucleótido es ADN de doble cadena.

20. Un vector que comprende el polinucleótido de la reivindicación 19 operativamente asociado a un promotor.

21. Una célula que comprende el vector de la reivindicación 20.

22. Una célula huésped que comprende el polinucleótido de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en la que la célula huésped es una célula de mamífero.

23. La célula huésped de la reivindicación 22, en la que la célula huésped es una célula humana.

24. La célula huésped de la reivindicación 23, en la que la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en una célula hepática, un linfocito T, un linfocito B y una célula HeLa.

25. La célula huésped de la reivindicación 24, en la que la célula huésped es una célula HeLa.