Procedimiento para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades que cursan con alteración de la quinasa p38,

elementos necesarios para llevarlo a cabo y sus aplicaciones.

La presente invención se refiere a un nuevo método para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades, desórdenes o patologías que cursan con alteración en la quinasa p38, preferentemente para enfermedades, desórdenes o patologías de origen autoinmune, inflamatorio o tumoral, (y más preferentemente para la artritis reumatoide y el lupus eritematoso sistémico), basado en la detección y cuantificación in vitro de la fosforilación de la Y323 de p38· y la regulación de su actividad, respectivamente, mediante el uso de un anticuerpo policlonal fosfoespecífico de dicho residuo. De esta manera se incluyen composiciones farmacéuticas útiles para dicho tratamiento y diagnóstico que comprenden un anticuerpo policlonal específico de dicha forma fosforilada proteica

Procedimiento para el diagnóstico y tratamiento de enfermedades que cursan con alteración de la quinasa p38, elementos necesarios para llevarlo a cabo y sus aplicaciones.

Campo de la técnica

Sector farmacéutico, biomédico e investigación académica. Concretamente la invención describe la generación y caracterización de anticuerpos fosfoespecíficos como herramientas de diagnóstico y marcador pronóstico y de remisión en ensayos clínicos de enfermedades humanas, más concretamente enfermedades autoinmunes y tumorales.

Estado de la técnica

Las proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAPK) regulan funciones críticas en el sistema inmune, incluyendo activación, proliferación, apoptosis y diferenciación de células T ^1-6. En la última década, las MAPK han despertado un enorme interés en la industria farmacéutica como posibles dianas farmacológicas en numerosas enfermedades. Se han identificado cuatro grupos de MAPKs conocidas como p38 MAPK, ERK, JNK y ERK5^5-10. La quinasa p38 se activa por distintos tipos de estrés incluidos estrés osmótico, radiación ultravioleta o citoquinas proinflamatorias como IL-1, IL-6 y TNFa^11-13. La señalización de p38 está implicada en importantes procesos fisiológicos como la producción de citoquinas, respuesta inflamatoria, funciones inmune y renal, respuesta a estrés oxidativo, autoinmunidad, y supresión tumoral ^14.15. A nivel celular, la activación de p38 controla numerosos procesos, incluyendo la regulación de factores de transcripción, síntesis de proteínas, expresión de receptores de membrana, regulación de proteínas de ciclo celular, inducción de senescencia y activación de apoptosis.

En las células de mamífero la actividad de p38 está regulada por una compleja cascada de fosforilación conocida como el mecanismo clásico de activación de MAPKs¹⁰. Diferentes citoquinas proinflamatorias estimulan GTPasas que a su vez activan las quinasas MKK3, MKK4 y MKK6 que fosforilan p38 en los residuos de Thr180-Tyr182, aumentando su actividad^16,17 Aunque se asumía que en las células T la activación de p38 está regulada exclusivamente por el mecanismo clásico de activación, recientemente se ha descubierto un sitio regulador crítico en la activación de p38, la tirosina en la posición 323. Se ha identificado una vía novel que acopla la estimulación del receptor de célula T (TCR) a la activación de p38 por un mecanismo independiente de MAPK. Esta ruta alternativa de activación de p38, está mediada por la tirosina quinasa Zap70¹⁸. La estimulación del TCR activa la proteína quinasa Lck, que fosforila a Zap70. Esta tirosina quinasa fosforila p38 en un residuo de tirosina situado en la posición 323. La fosforilación en la Tyr323 induce un proceso de autofosforilación y activación de p38 (Salvador et al Nat. Immunol, 2005, Solicitud de patente Nº WO 2005/077983).

Aunque la actividad de p38 se ha implicado en procesos inflamatorios, autoinmunes y cáncer, no se conoce en profundidad la función de esta ruta alternativa de activación de p38 en estos procesos, ni la implicación directa y específica con enfermedades concretas o si es una característica general de todas estas enfermedades descritas, que permitan desarrollar nuevas aplicaciones diagnósticas o terapéuticas específicas de las mismas. Por otro lado, para analizar la relevancia fisiológica de la ruta alternativa de activación de p38 en estos procesos patológicos es necesario generar herramientas metodológicas que permitan monitorizar y cuantificar con exactitud el grado de fosforilación del residuo de Tyr323 de p38 y al mismo tiempo mediante muestras biológicas adecuadas a estas células sanguíneas. Para ello, los inventores se propusieron desarrollar un anticuerpo fosfoespecífico frente a la Tyr323 de p38 que pudiera usarse en citometría de flujo. La citometría de flujo aporta numerosas ventajas con respecto al western-blot y tiene una aplicación directa en estudios poblacionales.

Descripción de la invención

Un aspecto de la presente invención lo constituye un procedimiento de diagnóstico y pronóstico de una enfermedad autoinmune, en adelante procedimiento de diagnóstico de la invención, basado en la determinación in vitro del nivel de fosforilación de la quinasa p38 en el residuo tirosina Y323 en células del sistema inmune, en una muestra biológica y que comprende las siguientes etapas:

Un aspecto particular de la invención lo constituye el procedimiento de diagnóstico de la invención donde la determinación de a) se realiza con un anticuerpo específico de la tirosina fosforilada (pY323) de la quinasa p38, más preferentemente, un anticuerpo policlonal, y más preferentemente, con un anticuerpo policlonal específico del péptido sintético de SEQ ID NO1, como el anticuerpo anti pY323 (anti-pTyr323) desarrollado en la presente invención (ver Ejemplos).

Un aspecto más particular de la invención lo constituye el procedimiento de diagnóstico de la invención donde la determinación de a) se realiza mediante citometría de flujo donde se seleccionan linfocitos T de la muestra biológica, preferentemente sangre.

Otro aspecto particular de la invención lo constituye el procedimiento de la invención en el que la enfermedad autoinmune que se diagnóstica pertenece al siguiente grupo: lupus eritematoso sistémico y artritis reumatoide.

Otro aspecto particular de la invención lo constituye el procedimiento de la invención en el que la enfermedad autoinmune que se diagnóstica en c) se lleva a cabo por la identificación de unos niveles similares a los obtenidos en el grupo control y que pertenece al siguiente grupo: espondilitis anquilosante.

Otro aspecto de la invención lo constituye un anticuerpo útil para el diagnóstico y diferenciación, pronóstico y seguimiento de enfermedades autoinmunes, en adelante anticuerpo de la invención, que comprende un anticuerpo de isotipo IgG específico del aminoácido Tyr323 fosforilado de la quinasa p38a.

Otro aspecto particular lo constituye un anticuerpo de la invención, ya sea monoclonal o policlonal, específico del péptido sintético de p38a (VADPpYDQSFE) (SEQ ID NO1), y más preferentemente un anticuerpo policlonal específico del péptido sintético de p38a (VADPpYDQSFE) (SEQ ID NO1).

Otro aspecto de la invención lo constituye el procedimiento de obtención del anticuerpo de la invención, en adelante procedimiento de la invención, basado en la generación del anticuerpo de la invención, preferentemente un anticuerpo policlonal, que comprende las siguientes etapas:

i) inmunización del animal mediante un péptido que contenga una tirosina fosforilada (Tyr323) representativa de la Tyr323 fosforilada de la proteína p38, preferentemente con el péptido VADPpYDQSFE ((319-328)-C(pY323), SEQ ID NO1),

ii) una etapa de purificación de los anticuerpos de isotipo IgG,

iii) una etapa de purificación de los anticuerpos que reconocen el péptido VADPpYDQSFE ((319-328)-C(pY323) fosforilado, por ejemplo, la IgG se pasa a través de una columna tiopropilsefarosa 6B acoplada con el péptido p38a(319-328)C(323pY), y opcionalmente

iv) preparación del anticuerpo del anticuerpo de la invención para posteriores estudios.

Otro aspecto particular de la invención lo constituye el procedimiento de la invención en el que el antígeno utilizado para inmunizar el animal de i) es el péptido VADPpYDQSFE ((319-328)-C(pY323), SEQ ID NO1).

Finalmente, otro aspecto de la invención lo constituye el uso-del anticuerpo de la invención en el diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento, en adelante uso del anticuerpo de la invención, in vitro de enfermedades, desórdenes o patologías que cursan con alteración de la quinasa p38.

Además, el anticuerpo de la invención puede ser utilizado, además del anterior uso como herramienta...

1. Procedimiento de diagnóstico y pronóstico de una enfermedad autoinmune caracterizado porque se basa en la determinación in vitro del nivel de fosforilación de la quinasa p38 en el residuo tirosina Y323 en células del sistema inmune y porque comprende las siguientes etapas:

a) identificación o determinación del nivel de fosforilación de la quinasa p38 en el residuo tirosina Y323, en una muestra biológica, preferentemente sangre y on células del sistema inmune, más preferentemente linfocitos T,

b) comparación de dicha determinación observada en a) con una muestra biológica control, y

c) diagnóstico y/o pronóstico de una enfermedad autoinmune cuando los niveles fosforilación superan a los obtenidos en la muestra control.

2. Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque la determinación de a) se realiza con un anticuerpo específico del péptido sintético de SEQ ID NO1, como el anticuerpo anti pY323, anti-pTyr323, específico de la Y323 fosforilada, desarrollado en la presente invención.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque la determinación de a) se realiza mediante una técnica capaz de detectar un anticuerpo perteneciente al siguiente grupo: citometría de flujo, Western blot, Dot blot, inmunoprecipitación, ELISA, enzimoinmunoensayo, dispositivo tipo biochip o microarray, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, inmunocitoquímica, microscopía confocal, microscopía de fluorescencia y Delfia.

4. Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque la técnica es citometría de flujo y porque se utiliza un anticuerpo policlonal específico del péptido sintético de SEQ ID NO1 y donde se seleccionan linfocitos T de la muestra biológica.

5. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a la 4 caracterizado porque la enfermedad autoinmune que se diagnóstica en c) pertenece al siguiente grupo: lupus eritematoso sistémico y artritis reumatoide.

6. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a la 4 caracterizado porque la enfermedad autoinmune que se diagnóstica en c) pertenece al siguiente grupo: espondilitis anquilosante.

7. Anticuerpo útil para el diagnóstico, pronóstico y seguimiento de enfermedades autoinmunes caracterizado porque es un anticuerpo específico del péptido sintético de p38a (VADPpYDQSFE) (SEQ ID NO1).

8. Anticuerpo según la reivindicación 7 caracterizado porque es policlonal o monoclonal.

9. Procedimiento de obtención del anticuerpo según las reivindicaciones 7 y 8 caracterizado porque es un anticuerpo policlonal y porque comprende las siguientes etapas:

10. Procedimiento según la reivindicación 9 caracterizado porque el antígeno utilizado para inmunizar el animal en i) es el péptido VADPpYDQSFE ((319-328)-C(pY323), SEQ ID NO1).

11. Uso del anticuerpo según las reivindicaciones 7 y 8 en el diagnóstico, pronóstico y/o seguimiento, in vitro de enfermedades, desórdenes o patologías que cursan con alteración de la quinasa p38.

12. Uso del anticuerpo según la reivindicación 11 caracterizado porque la enfermedad, desorden o patología es de origen autoinmune perteneciente al siguiente grupo: Artritis reumatoide juvenil, Osteoartritis, Artritis psoriática, Esclerosis múltiple, Miastenia gravis, Lupus eritematoso sistémico, Lupus eritematoso cutáneo, Diabetes mellitas, Nefritis autoinmune o lúpica, Sindrome GoodPateur, Enfermedad de Addison autoinmune, Tiroiditis autoinmune, Dermatitis atópica, Dermatitis eccematosa, Psoriasis, Pénfigo, Sindrome Sjöngren, Alopecia areata, Respuesta alérgica debida a infección por picadura de artrópodos, Enfermedad inflamatoria intestinal (Enfermedad de Crohn y Colitis ulcerosa), Enfermedad celiaca, Úlcera aftosa, Iritis, Conjuntivitis, Queratoconjuntivitis, Asma, Asma alérgico, Escleroderma, Tiroiditis, Vaginitis, Prostatitis, Erupción por drogas, Reacciones de inversión en la lepra, Eritema nodoso leproso, Uveítis autoinmune (anterior, intermedia y posterior), Encefalomielitis alérgica, Encefalomielitis autoinmune, Fiebre reumática, Encefalopatía hemorrágica aguda necrotizante, Pérdida del oído sensoneuronal progresiva bilateral idiomática, Gingivitis, Anemia aplásica, Aplasia pura de células roja, Trombocitopenia idiomática, Policondritis, Granulomatosis de Wegener, Hepatitis crónica activa, Sindrome de Stevens-Johnson, Esprue idiomático, Manifestaciones cutáneas del liquen plano, Oftalmopatía de Graves, Sarcoidosis, Cirrosis biliar primaria, Fibrosis pulmonar intersticial, Pancreatitis Linfoplasmocitaria Esclerosante y Pancreatitis aguda.

13. Uso del anticuerpo según la reivindicación 11 caracterizado porque la enfermedad, desorden o patología es de origen tumoral.

14. Uso del anticuerpo según la reivindicación 11 caracterizado porque la enfermedad, desorden o patología es de origen inflamatorio perteneciente al siguiente grupo: enfermedad de injerto contra huésped en trasplantes e infecciones virales.

15. Uso del anticuerpo según las reivindicaciones 7 y 8 en un procedimiento biotecnológico de identificación de la proteína p38 fosforilada en la Y323 perteneciente al siguiente grupo:

i) procedimiento de identificación de compuestos, preferentemente inhibidores, que alteran la actividad de la proteína p38 mediada por dicha Y323 fosforilada, o en un

ii) procedimiento de elaboración de una composición terapéutica útil para el tratamiento de enfermedades que cursen con una alteración de la expresión de esta forma fosforilada Y323 de p38.

16. Composición farmacéutica o medicamento útil para el tratamiento de enfermedades que cursen con alteración de la proteína p38 fosforilada en Y323 caracterizado porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo específico de la proteína p38 fosforilada en Y323, ya sea monoclonal o policlonal, preferentemente un anticuerpo policlonal específico del péptido de secuencia SEQ ID NO1, junto con, opcionalmente, uno o más adyuvantes y/o vehículos farmacéuticamente aceptables.

17. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 16 en un método de tratamiento de un mamífero, preferentemente un ser humano, afectado por una enfermedad que cursa con alteración de la expresión de la proteína p38 fosforilada en Y323 consistente en la administración de dicha composición terapéutica que inhibe la actividad de dicha proteína.

18. Uso de la composición farmacéutica según la reivindicación 17 caracterizado porque la enfermedad pertenece al siguiente grupo: enfermedades autoinmunes -preferentemente, lupus eritematoso sistémico y artritis reumatoide-, alérgicas, inflamatorias, alteraciones linfoproliferativas como leucemias y cánceres.