DOT1 HISTONA METILTRANSFERASAS COMO DIANA PARA IDENTIFICAR AGENTES TERAPEUTICOS PARA LEUCEMIA.
Método de identificación de un compuesto candidato para la prevención y/o el tratamiento de leucemia,
que comprende:
poner en contacto un polipéptido DOT1 L o una proteína de fusión que comprende el polipéptido DOT1 L con un sustrato de nucleosoma que comprende histona H3 en presencia de un compuesto de prueba, comprendiendo el polipéptido DOT1 L una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
(a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2;
(b) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95% de similitud de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:2, en la que dicho polipéptido DOT1L tiene actividad histona H3 lisina 79 (H3-K79) metiltransferasa; y
(c) un fragmento funcional de al menos 400 aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de (a) o (b) anterior, comprendiendo dicho fragmento funcional un dominio catalítico de DOT1 L histona metiltransferasa y teniendo actividad H3-K79 metiltransferasa;
detectar el nivel de metilación de histona H3 lisina 79 (H3-K79) del sustrato de nucleosoma en condiciones suficientes para proporcionar la metilación de H3-K79,
en el que una reducción en la metilación de H3-K79 en presencia del compuesto de prueba en comparación con el nivel de metilación de H3-K79 en ausencia del compuesto de prueba indica que el compuesto de prueba es un compuesto candidato para la prevención y/o el tratamiento de leucemia
Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W04028289US.
Solicitante: UNIVERSITY OF NORTH CAROLINA AT CHAPEL HILL.
Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.
Dirección: 308 BYNUM HALL, CAMPUS BOX 4105,CHAPEL HILL, NC 27599-4105.
Inventor/es: ZHANG, YI, FENG,QIN, OKADA,YUKI, XU,GUOLIANG.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 21 de Octubre de 2009.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N9/10A1A
- C12Q1/68M6B
Clasificación PCT:
- C12N9/10 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Transferasas (2.) (ribonucleasas C12N 9/22).
- C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
Clasificación antigua:
- C12Q1/68 C12Q 1/00 […] › en los que intervienen ácidos nucleicos.
Fragmento de la descripción:
DOT1 histona metiltransferasas como diana para identificar agentes terapéuticos para leucemia.
Declaración de apoyo federal
Esta invención se realizó con el apoyo federal con la subvención n.º GM63076 y GM68804 concedidos por los Institutos Nacionales de Salud/Instituto Nacional del Cáncer. El gobierno de los Estados Unidos tiene determinados derechos en la invención.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a histona metiltransferasas novedosas así como a ácidos nucleicos que codifican para las mismas; también se dan a conocer métodos para identificar compuestos que modulan la actividad de la histona metiltransferasa, métodos de identificación de compuestos que inhiben la unión de un polipéptido a la histona metiltransferasa, métodos de identificación de compuestos candidatos para el tratamiento de leucemia y métodos de diagnóstico basados en la metilación de histonas.
Antecedentes de la invención
Las estructuras de la cromatina de orden superior son de profunda importancia en la regulación génica y la herencia epigenética (Wu y Grunstein (2000) Trends Biochem. Sci. 25:619-623). Las modificaciones postraduccionales de histonas de núcleo influyen de manera crítica en el establecimiento y mantenimiento de las estructuras de la cromatina de orden superior. Las colas sin estructura de determinadas histonas de núcleo se modifican mucho mediante acetilación, metilación, fosforilación, ribosilación y ubiquitinación. Una hipótesis de "código de histonas", que asocia modificaciones de histonas a estructuras de la cromatina, ha sido el centro de estudios recientes intensos (Strahl y Allis (2000) Mol. Cell. Biol. 22:1298-1306; Turner (2000) Bioessays 22:836-845). La metilación de histonas ha surgido como una forma principal de modificación de histonas. (Strahl y Allis (2000) Mol. Cell. Biol. 22:1298-1306; Zhang y Reinberg (2001) Genes Dev. 15:2343-2360). En particular, se ha identificado una gran familia de histona metiltransferasas (HMTasas) que contienen el dominio SET (Lachner y Jenuwein (2002) Curr. Opin. Cell Biol. 14:286-298). Se ha demostrado que las proteínas del dominio SET metilan diversos residuos de lisina N-terminales de histona H3 y H4. La metilación de lisina de histona se ha asociado con diversos procesos biológicos que oscilan desde regulación transcripcional hasta la transmisión fiel de cromosomas durante la división celular (Grewal y Elgin (2002) Curr. Opin. Genet. Dev. 12:178-187).
Además, la metilación de lisina catalizada por proteínas que contienen el dominio SET se ha asociado a cáncer (Schneider, et al. (2002) Trends Biochem. Sci. 27:396-402). Por ejemplo, la H3-K4 metiltransferasa MLL se transloca con frecuencia en leucemia (Ayton y Cleary (2001) Oncogene 20:5695-5707; Milne, et al. (2002) Mol. Cell 10:1107-1117; Nakamura, et al. (2002) Mol. Cell 10:1119-1128) y la H3-K27 metiltransferasa EZH2 se sobreexpresa en varios tumores y su nivel de expresión se correlaciona con la invasividad de estos tumores (Bracken, et al. (2003) EMBO J. 22:5323-5335; Kleer, et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:11606-1161-1; Varambally, et al. (2002) Nature 419:624-9).
La translocación cromosómica es una de las principales causas de cáncer en seres humanos, particularmente en leucemias agudas. La redisposición cromosómica más común encontrada en pacientes con leucemia implica el gen de leucemia de linaje mixto MLL (también denominado ALL o HRX) ubicado en 11q23 (Ayton y Cleary (2001) Oncogene 20:5695-5707). MLL es el homólogo humano de Trithorax (Trx) de Drosophila, una proteína implicada en el mantenimiento del "estado activado" de la expresión génica de la caja homeótica (Hox) durante el desarrollo embrionario. MLL contiene varios motivos funcionales que incluyen el motivo de unión a ADN gancho AT N-terminal y el dominio SET C-terminal requeridos para su actividad H3-lisina 4 metiltransferasa (Milne, et al. (2002) Mol. Cell 10:1107-1117; Nakamura, et al. (2002) Mol. Cell 10:1119-1128). Como resultado de la translocación cromosómica, los extremos N-terminales de MLL se fusionan en el marco con una o más de 30 proteínas componentes (Ayton y Cleary (2001) Oncogene 20:5695-5707). Independientemente de si el componente de fusión está ubicado normalmente en el núcleo o citoplasma, las quimeras son siempre nucleares (Dimartino y Cleary (1999) Br. J. Haematol. 106:614-626). Dado que el dominio de unión a ADN de MLL está todavía retenido en las proteínas de fusión, los genes diana de MLL se regularán de manera diferente como resultado de la pérdida del dominio SET de MLL y la obtención de una función de componente de fusión en las quimeras. HOXA9 ha surgido como uno de los genes diana de MLL más relevantes en leucemia mieloide aguda (LMA) humana ya que siempre está regulado por incremento en LMA (Golub, et al. (1999) Science 286:531-537). De hecho, el potencial leucemogénico de Hoxa9 se demostró directamente por el desarrollo de LMA en ratones que recibieron un trasplante de células de médula ósea que sobreexpresaban Hoxa9 (Kroon, et al. (1998) EMBO J. 17: 3714-3725). Se ha demostrado que tanto Hoxa7 como Hoxa9 se requieren para que las proteínas de fusión MLL transformen células progenitoras mieloides (Ayton y Cleary (2003) Genes Dev. 17:2298-2307). Sin embargo, el mecanismo mediante el cual diferentes proteínas de fusión MLL regulan por incremento HOXA9 y cómo los niveles superiores de HOXA9 conducen a leucemia siguen teniendo que aclararse.
Dot1 es una proteína conservada de manera evolutiva que se identificó originariamente en S. cerevisiae como molécula interruptora de silenciamiento telomérico (Singer, et al, (1998) Genetics 150:613-632). También actúa en la vigilancia de paquiteno durante el ciclo celular meiótico (San-Segundo y Roeder (2000) Mol. Biol. Cell. 11:3601-3615). El análisis de secuencia de Dot1 de levadura reveló que tiene ciertos motivos de unión a SAM característicos, similares a los de en la proteína arginina metiltransferasas (Dlakic (2001) Trends Biochem. Sci. 26:405-407).
Sumario de la invención
La presente invención se basa, en parte, en la primera identificación de una modificación postraduccional dentro del dominio globular de la histona. En particular, los inventores han observado la metilación de lisina 79 de histona H3 ("H3-K79") y han identificado una clase novedosa de histona metiltransferasa (HMTasa) designada "DOT1" que metila H3-K79 in vivo. DOT1 L (véase, por ejemplo, SEQ ID NO:2) es un miembro de la familia DOT1. De manera similar a otras HMTasas, los polipéptidos DOT1 contienen un sitio de unión a S-adenosilmetionina (SAM) y usan SAM como donador de metilo. Sin embargo, a diferencia de otras HMTasas notificadas, los polipéptidos DOT1 no contienen un dominio SET.
La presente invención describe un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido DOT1L, secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en:
Reivindicaciones:
1. Método de identificación de un compuesto candidato para la prevención y/o el tratamiento de leucemia, que comprende:
poner en contacto un polipéptido DOT1 L o una proteína de fusión que comprende el polipéptido DOT1 L con un sustrato de nucleosoma que comprende histona H3 en presencia de un compuesto de prueba, comprendiendo el polipéptido DOT1 L una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
detectar el nivel de metilación de histona H3 lisina 79 (H3-K79) del sustrato de nucleosoma en condiciones suficientes para proporcionar la metilación de H3-K79,
en el que una reducción en la metilación de H3-K79 en presencia del compuesto de prueba en comparación con el nivel de metilación de H3-K79 en ausencia del compuesto de prueba indica que el compuesto de prueba es un compuesto candidato para la prevención y/o el tratamiento de leucemia.
2. Método según la reivindicación 1, llevándose a cabo el método como ensayo sin células o como ensayo a base de células.
3. Método según la reivindicación 2, en el que, en el caso de usar un ensayo a base de células, el polipéptido DOT1 L se expresa a partir de un ácido nucleico.
4. Método de identificación de un compuesto candidato para la prevención y/o el tratamiento de leucemia, que comprende:
poner en contacto un polipéptido DOT1 L con AF10 o una proteína de fusión MLL en presencia de un compuesto de prueba, comprendiendo el polipéptido DOT1L una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:
detectar el nivel de unión entre el polipéptido DOT1L y AF10 o la proteína de fusión MLL en condiciones suficientes para la unión del polipéptido DOT1 L a AF10 o la proteína de fusión MLL,
en el que una reducción en la unión entre el polipéptido DOT1L y AF1 0 o la proteína de fusión MLL en presencia del compuesto de prueba en comparación con el nivel de unión en ausencia del compuesto de prueba indica que el compuesto de prueba es un compuesto candidato para la prevención y/o el tratamiento de leucemia.
5. Método según la reivindicación 4, en el que la proteína de fusión MLL es una proteína de fusión MLL-AF10.
6. Método según cualquier reivindicación 4 ó 5, llevándose a cabo el método como ensayo sin células o como ensayo a base de células.
7. Método según la reivindicación 6, en el que, en el caso de usar un ensayo a base de células, el polipéptido DOT1 L y/o AF10 o la proteína de fusión MLL se expresa a partir de un ácido nucleico.
8. Método in vitro para diagnosticar si un sujeto tiene o corre el riesgo de desarrollar leucemia y/o determinar el pronóstico de la evolución de la enfermedad, que comprende:
en el que una elevación en la metilación de H3-K79 asociada con HoxA9 en la muestra biológica en comparación con el nivel de metilación de H3-K79 asociada con HoxA9 en una muestra biológica no leucémica es un diagnóstico de que el sujeto tiene o corre el riesgo de desarrollar leucemia y/o es un pronóstico de la evolución de la enfermedad en el sujeto.
9. Método según la reivindicación 8, en el que la muestra biológica se selecciona del grupo que comprende; una célula; muestra tisular; muestra de células B; muestra de médula ósea; y una preparación de nucleosomas.
10. Método según la reivindicación 9, comprendiendo el método además detectar el nivel de metilación de histona H3 lisina 4 asociada con el gen HoxA9.
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