Fuente de tejido de hígado.

Método de tratamiento de un tejido de hígado de donante no fetal para obtener una población enriquecida de célulasprogenitoras de hígado comprendiendo:

(a) provisión de tejido de donante no fetal obtenido entre aproximadamente 2 horas y aproximadamente 30 horas postmortem;

y

(b) tratamiento de dicho tejido de donante no fetal para obtener una población enriquecida de células progenitoras dehígado.

Fuente de tejido de hígado

1. Campo de la invención

Esta invención generalmente se refiere a obtención de células diploides, incluyendo células progenitoras o madre, de tejidos de cadáveres de donantes con corazones parados.

2. Antecedentes de la invención

Hay un fuerte interés comercial y clínico en el aislamiento e identificación de células progenitoras inmaduras de hígado debido al impacto que tal población celular podría tener en el tratamiento de enfermedades del hígado. Cada año en Estados Unidos, hay aproximadamente 300.000 hospitalizaciones anuales por insuficiencia hepática. Trasplantes de hígado son curativos para algunas formas de insuficiencia hepática, y aproximadamente 4800 trasplantes se realizan al año en Estados Unidos. Uno de los factores limitantes en el trasplante de hígado es la disponibilidad de hígados donantes especialmente dada la restricción que suponen hígados donantes para trasplante de órganos procedentes de pacientes que han sufrido muerte cerebral pero no parada cardiaca. Hígados de cadáveres (asistólicos) donantes no han sido exitosos, aunque recientes esfuerzos para usar tales donantes han apoyado la posibilidad del uso de estos si el hígado se obtiene dentro de la media hora después de la muerte.

Trasplante celular en el hígado es una terapia alternativa atractiva para la mayoría de enfermedades del hígado. Los procedimientos quirúrgicos para trasplante celular son menores en relación a aquellos necesitados para trasplante de órganos enteros y, por lo tanto, se pueden usar en pacientes con varios riesgos quirúrgicos tales como la edad o enfermedad. El uso de células hepáticas humanas es superior a células hepáticas derivadas de otros mamíferos debido a que los patógenos potenciales, si los hay, son de origen humano y podrían ser ambos mejor tolerados por pacientes y fácilmente seleccionados antes de uso.

Intentos se han hecho en el pasado para obtener la población de células hepáticas progenitoras, que han sido propuestas como la población más versátil para terapia celular y genética del hígado. Las patentes US 5, 576, 207 y 5, 789, 246 a Reid et al. que utilizó marcadores celulares superficiales y laterales dispersan citometría de flujo para proporcionar una sub-población definida en el hígado. Progenitores hepáticos son células diploides que ellas mismas o su progenie son capaces de diferenciar en hepatocitos.

Progenitores de hígado son también extremadamente útiles para la producción de factores de crecimiento. Estos podrían asociarse a su crecimiento o al de otros progenitores en el hígado (p. ej. progenitores mesenquimales o hemapoyéticos) y podrían también incluir factores de crecimiento no descubiertos aún asociados a pasos tempranos en la dedicación de células progenitoras hepáticas a un linaje particular. Estos factores de crecimiento nuevos podrían tener potencial en el tratamiento de la enfermedad hepática o en el control de los cánceres de hígado, ahora reconocidos como transformantes de los progenitores de hígado.

Además, progenitores de hígado son vehículos para terapia genética, donde los progenitores insertados genéticamente transformados o hepáticos normales promueven la salud del individuo en aquellos en los que progenitores hepáticos se trasplantan.

Intentos de ejecutar trasplante de células hepáticas han hecho uso de células de hígado maduras no fraccionadas y han mostrado alguna medida de eficacia. No obstante, los éxitos requieren inyección de números grandes de células (10-20 billones) , ya que las células han limitado potencial de crecimiento in vivo. Además, la introducción de números sustanciales de células hepáticas maduras grandes (diámetro de célula medio 25-50 µm) se complica por su tendencia a formar agregados grandes sobre inyección, dando como resultado émbolos potencialmente fatales. Por otra parte, estas células suscitan una respuesta de rechazo inmunológico marcado forzando a pacientes a ser mantenidos con fármacos inmunosupresores para el resto de sus vidas.

Células hepáticas maduras diferenciadas son distinguibles de células hepáticas progenitoras por diferentes criterios. Las células diferenciadas tienden a formar aglomerados o agregados, que, si se inyectan en un paciente, suponen un riesgo de formación de émbolos. Las células diferenciadas son particularmente resistentes a crioconservación y son sobre todo inmunogénicas. Por otra parte, como la capacidad de duplicación de las células diferenciadas está limitada, el trasplante con células diferenciadas tiene pocas, si no ninguna ventaja en comparación con trasplante de órganos, y desventajas que incluyen un procedimiento más elaborado de preparación.

La escasez de órganos esenciales, por ejemplo, corazón, hígado, páncreas, pulmón y riñón, para trasplante u otros fines médicos que requieren tejidos donantes se debe a la disponibilidad limitada de órganos que todavía son funcionales. Habitualmente, los órganos destinados para trasplantes se recuperan de donantes con muerte cerebral cuyos corazones todavía laten. Si el corazón se detiene, la circulación sanguínea se detiene (isquemia) , lo que interrumpe la oxigenación de tejidos (anoxia) y, en consecuencia, los órganos se dañan isquémicamente dentro de un periodo temporal muy corto dando como resultado probabilidad casi cierta de que tales órganos no funcionen cuando se trasplantan. En general, ninguno de los órganos se usan después de detención del corazón y, experimentalmente, ninguno se usa después de más de media hora del tiempo de detención del corazón o asistolia. Habitualmente, sólo 12% de muertes en hospitales cumple el criterio de muerte cerebral-corazón que late. No obstante, una fuente de órganos grande y aún inexplotada para trasplante está disponible, muchas de víctimas de accidentes que o bien mueren en el sitio de una herida o tienen un tiempo de supervivencia post-trauma corto. Estas víctimas de accidente no se usancomo donantes de órganos debido al daño isquémico. Órganos tales como hígado, cerebro y corazón están entre los tejidos más sensibles a isquemia. Por ejemplo, heridas cerebrales isquémicas y anóxicas de paro cardíaco suponen daño al cerebro y a tejidos neurológicos asociados después de aproximadamente cuatro minutos. El corazón puede sobrevivir intacto hasta cuatro horas después de paro cardíaco. El hígado puede sobrevivir funcionalmente durante no más de una hora y trasplantes de donantes a corazón parado (NHBD) se recomiendan que sean realizados preferiblemente dentro de los primeros treinta y cinco minutos de exposición para isquemia caliente (ver los resúmenes, incorporados por referencia, de los artículos por Ong HS, Soo KC, Joseph VT, Tan SY, Jeyaraj PR. La viabilidad de injertos de hígado para trasplante después de isquemia caliente prolongada. Ann Acad Med Singapore 1999 Jan;28 (1) :25-30; Hong HQ, Yin HR, Zhu SL, Lin YT. Los resultados de hígados de trasplante de donantes seleccionados de cadáveres de corazones parados. Hiroshima J Med Sci 1991 Sep;40 (3) :87-91. Bajo los presentes reglamentos médicos, el tiempo antes de que de un órgano potencialmente transferible pueda ser rescatado se retrasa normalmente. Esto ocurre debido a que el donante potencial debe llevarse primero a un hospital o a una morgue. La familia debe luego firmar los formularios de donación de órganos. Solo después de que los procedimientos de donación de órganos se completan, se le permite a un equipo quirúrgico acceder al cuerpo para recoger los órganos. Debido al tiempo transcurrido debido a estos procedimientos en muchas ocasiones los órganos se han dañado ya irreversiblemente o no son ya viables. Por consiguiente, la técnica anterior proporciona un gran número de métodos y procesos para órganos de donantes para protección de daño isquémico. Ver por ejemplo las patentes US nº 5, 702, 881; 5, 660, 976; 5, 752, 929; 5, 863, 296; 5, 855, 617; 5, 843, 024; 5, 827, 222; 5, 723, 282; 5, 514, 536; y 4, 723, 939 entre muchos otros. A pesar de la abundancia de referencias de la técnica anterior dirigidas a medios de protección de órganos de donantes de la pérdida de funcionalidad, la técnica anterior es silenciosa en lo que se refiere al uso de cadáveres cuyos corazones se detuvieron más allá del punto de tiempo irreversible. Solo las tres patentes US nº (5, 843, 024; 5, 702, 881; 4, 723, 939) parecen tratar donantes de corazón parado. Esta técnica anterior no enseña el uso de órganos "irreparable" para aislamiento de células progenitoras de estos. Mientras métodos de aislamiento de células precursoras hepáticas se conocen en la técnica (ver, por ejemplo, las patentes nº 5, 576, 207 y 5, 789, 246) hasta la reducción a la práctica... [Seguir leyendo]

1. Método de tratamiento de un tejido de hígado de donante no fetal para obtener una población enriquecida de células progenitoras de hígado comprendiendo:

(a) provisión de tejido de donante no fetal obtenido entre aproximadamente 2 horas y aproximadamente 30 horas postmortem; y

(b) tratamiento de dicho tejido de donante no fetal para obtener una población enriquecida de células progenitoras de hígado.

2. Método según la reivindicación 1, en el que el tejido donante se obtiene dentro de aproximadamente 2 horas y tres o seis horas después de que el latido del corazón se pare.

3. Método según la reivindicación 1 o 2, en el que el tejido donante se enfría.

4. Método según la reivindicación 3, en el que el tejido donante se enfría a aproximadamente 4 °C.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el donante es un adulto.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el donante es un cerdo o un primate.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el paso de tratamiento proporciona una suspensión de célula sustancialmente única o un explante.

8. Método según la reivindicación 7, en el que el paso de tratamiento comprende adicionalmente la selección de la suspensión de aquellas células que expresan al menos un marcador asociado positivamente o negativamente con al menos un linaje de célula progenitora de hígado.

9. Método según la reivindicación 7, en el que el paso de tratamiento comprende adicionalmente un paso de reducción, para proporcionar una suspensión celular reducida enriquecida en progenitores de hígado que muestran al menos un marcador asociado a al menos un linaje de célula progenitora de hígado.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 8-9, en el que al menos un linaje de célula progenitora de hígado incluye linaje de célula hepática.

11. Método de procuración de células progenitoras de hígado, comprendiendo:

(a) provisión de un donante de corazón parado entre aproximadamente 2 horas y 30 horas post-mortem como fuente de tejido de hígado;

(b) obtención de tejido de hígado de dicho donante; y

(c) tratamiento del tejido de hígado para obtener las células progenitoras de hígado.

12. Método según la reivindicación 11, en el que el donante es un mamífero.

13. Método según la reivindicación 12, en el que el mamífero es un humano.

14. Método según las reivindicaciones 11-13, en el que las células progenitoras de hígado tienen capacidad para desarrollarse en hepatocitos, células biliares, o una combinación de estos.

15. Método según las reivindicaciones 11-14, en el que las células del donante expresan al menos uno de alfafetoproteína, albúmina, sialoproteína de hueso, CD14, CD34, CD38, CD90, CD45, CD117, ICAM-1, colágeno tipo I, colágeno tipo II, colágeno tipo III, glicoforina A, u osteopontina.

16. Método de tratamiento de un tejido de hígado con al menos una población de célula progenitora de hígado como fuente de células progenitoras de hígado, comprendiendo:

(a) recogida del tejido de hígado de un donante con un corazón parado entre aproximadamente 2 horas y 30 horas postmortem, el tejido de hígado con al menos una población de célula progenitora de hígado; y

(b) tratamiento posterior del tejido recogido para obtener células progenitoras de hígado.

17. Método de tratamiento de tejido de hígado de donante fetal para obtener una población enriquecida de células progenitoras de hígado comprendiendo:

(a) provisión de tejido de hígado humano fetal obtenido entre aproximadamente 2 horas y aproximadamente 30 horas post-mortem; y

(b) tratamiento de dicho tejido humano fetal para obtener una población enriquecida de células progenitoras de hígado.

18. Método de tratamiento de un tejido de hígado con al menos una población de célula diploide como fuente de células diploides, comprendiendo:

(a) recogida de un tejido de hígado de un donante con un corazón parado y entre aproximadamente 2 horas y aproximadamente 30 horas post-mortem en un momento en que se recoge el tejido del hígado, sospechándose que el tejido de hígado tiene al menos una población de célula diploide;

(b) tratamiento del tejido de hígado recogido para obtener una población de células enriquecida con células diploides.

19. Método según la reivindicación 18, en el que el donante no es un feto.

20. Método según la reivindicación 18 o 19, en el que el donante es un adulto.

21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 18-20, en el que las células diploides incluyen progenitores de hígado.

22. Método según cualquiera de las reivindicaciones 18-21, en el que el paso de tratamiento comprende el tratamiento del tejido de hígado recogido para proporcionar una única suspensión celular.

23. Método según la reivindicación 22, en el que el paso de tratamiento comprende además la separación de la suspensión celular única en dos o más fracciones.

24. Método según la reivindicación 23, en el que el paso de separación separa células más grandes de células más pequeñas, células de densidad más alta de células de densidad inferior, o ambos.

25. Método según la reivindicación 24 en el que una o más fracciones que consisten esencialmente en células más pequeñas, células de densidad inferior, o ambos, son procesadas posteriormente para proporcionar una población de células enriquecida con células diploides.

26. Método según la reivindicación 21, en el que las células diploides incluyen progenitores de hígado que expresan alfa-fetoproteína.

27. Método según cualquiera de las reivindicaciones 18-21, en el que el tejido se recoge dentro de aproximadamente 2 horas y aproximadamente tres o seis horas después de que el latido del corazón se pare.