METODO DE CRIBADO DE COMPUESTOS CANDIDATOS POR LA SUSCEPTIBILIDAD A LA EXCRECION BILIAR.

Método de cribado de un compuesto candidato por la susceptibilidad a la excreción biliar,

comprendiendo el método las etapas de:

(a) proporcionar un cultivo de hepatocitos, comprendiendo el cultivo por lo menos un canalículo biliar;

(b) exponer un compuesto candidato y una cantidad preseleccionada de un compuesto marcador al cultivo durante un tiempo suficiente para permitir la captación;

(c) lavar el cultivo; y

(d) detectar una cantidad de compuesto marcador presente en por lo menos un canalículo biliar en el cultivo, indicando la presencia o ausencia de una cantidad reducida del compuesto marcador en comparación con la cantidad preseleccionada del compuesto marcador la susceptibilidad del compuesto candidato a la excreción biliar

Método de cribado de compuestos candidatos por la susceptibilidad a la excreción biliar.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método de cribado ("screening") de compuestos que son candidatos principalmente para el uso como agentes terapéuticos por la susceptibilidad a la excreción biliar. Más particularmente, la presente invención se refiere a un método in vitro de cribado de compuestos candidatos por la susceptibilidad a la excreción biliar. Los compuestos se pueden elegir para su uso como agentes terapéuticos para la administración a humanos y otros vertebrados de sangre caliente.

Tabla de abreviaturas

AUC - área bajo la curva

BSEP - bomba de exportación de sal biliar

ClB - depuración biliar

Clin - depuración intrínseca

cMOAT - transportador canalicular multiespecífico de aniones orgánicos

CFDA - diacetato de carboxifluoresceína

DMEM - medio de Eagle modificado por Dulbecco

EDTA - etilendiamino tetraacetato

HP - Hewlett Packard

HPLC - cromatografía líquida de alto rendimiento

h - hora

i.v. - intravenoso

i.p. - intraperitoneal

Km - constante de Michaelis-Menten para la reacción enzima-sustrato

LC/MS - cromatografía líquida/espectrometría de masas

mg pr. - miligramos de proteínas

min - minuto

MDR2 - proteína 2 de resistencia a multifármacos

MRP2 - proteína asociada 2 de resistencia a multifármacos

Ntcp - Polipéptido cotransportador de Na+/taurocolato

OATP1 - polipéptido transportador de aniones orgánicos 1

OATP2 - polipéptido transportador de aniones orgánicos 1

P-gp - P-glicoproteína

SD - desviación estándar

UV - ultravioleta

UV/VIS - ultravioleta/visible

Vmax - velocidad máxima de reacción catalizada por enzima

Técnica anterior

El metabolismo de primer paso se refiere a la absorción de agentes terapéuticos, fármacos u otros compuestos en el suministro portal de sangre que conduce al hígado. Cuando se ingiere un fármaco, el estómago y el intestino delgado lo absorben, con el posterior flujo en la sangre hacia la entrada de la vena porta al hígado. El hígado puede entonces a su vez absorber rápidamente y metabolizar el fármaco en altas concentraciones a través del suministro de sangre al hígado. De este modo, grandes cantidades de fármacos pueden ser no observadas por la circulación sistémica o el punto de efecto del fármaco. Adicionalmente, un metabolismo rápido a través de la ruta metabólica de primer paso puede conducir a la formación de concentraciones elevadas en plasma de metabolitos no deseados.

De este modo, en el hígado, las composiciones terapéuticas frecuentemente se eliminan sin desearlo del sistema de circulación del animal en el que son captadas por los hepatocitos (células hepáticas) y se excretan en la bilis a través de los canalículos biliares. La captación en los hepatocitos está mediada por sistemas de transporte endógenos a los hepatocitos, incluyendo Ntcp y cMOAT. Dichos transportadores trasladan xenobióticos, tales como composiciones terapéuticas, así como compuestos endógenos, a través de la membrana sinusoidal de los hepatocitos. Los canalículos biliares son estructuras del tejido hepático que reciben componentes excretados desde los hepatocitos y transportan la bilis a un conducto biliar común para eliminarlo del animal. La excreción biliar de sustratos es por tanto un proceso complejo que implica la translocación a través de la membrana sinusoidal, el movimiento a través del citoplasma y el transporte a través de la membrana canalicular.

La llegada de las técnicas de química combinatoria ha permitido la identificación de cantidades extremadamente elevadas de compuestos que presentan un potencial como agentes terapéuticos. Sin embargo, los análisis por la susceptibilidad a la excreción biliar que pueden identificar rápidamente aquellos compuestos candidatos que pueden tener un menor potencial para la captación por hepatocitos y la excreción a través de los canalículos biliares han dejado atrás el paso de la síntesis y el cribado de actividades farmacológicas. Se han utilizado numerosas preparaciones in vivo (por ejemplo, animales canulados por el conducto biliar) y preparaciones in vitro (por ejemplo, hígados perfundidos aislados, hepatocitos aislados, duplas de hepatocitos, vesículas de membranas plasmáticas hepáticas y proteínas de transporte expresadas) para investigar los procesos de excreción biliar. Véase, por ejemplo, Oude Elferink et al., Biochim. Biophys. Acta 1241:215-268, 1995.

Adicionalmente, se han utilizado duplas de hepatocitos cultivo a corto plazo (3-8 horas) para examinar directamente la excreción biliar de compuestos fluorescentes utilizando microscopía de fluorescencia, tal como se ha descrito por Graf y Boyer, J. Hepatol. 10:387-394, 1990. Sin embargo, la aplicación de duplas de hepatocitos cultivados para estudiar la excreción biliar de xenobióticos está limitada en que el sustrato debe contener un cromóforo fluorescente.

Se han descrito hepatocitos cultivados a largo plazo (habitualmente más de 24 horas) para restaurar la polaridad con estructuras de tipo canalicular. Véase, por ejemplo, Barth y Schwarz, Proc. Natl. Acad. Sci. 79:4985-4987, 1982; Maurice et al., J. Cell Sci. 90:79-92, 1988; Talamini et al., Hepatology 25:167-172, 1997. Aunque se han utilizado hepatocitos primarios mantenidos bajo condiciones de cultivo convencionales para estudiar el metabolismo de fármacos y la hepatoxicidad, los cultivos de hepatocitos a largo plazo no han sido un modelo adecuado para estudiar el transporte hepatobiliar. Particularmente, tal como se ha descrito por Groothuis y Meijer, J. Hepatology 24(Suppl. 1):3-28, 1996 y LeCluyse et al., Adv. Drug Del. Rev. 22:133-186, 1996, en dichos cultivos se han observado una rápida pérdida de la función específica del hígado, incluyendo propiedades de transporte hepático, y no se ha conseguido el establecimiento de las redes canaliculares normales de bilis y el mantenimiento de la morfología normal de los hepatocitos.

WO94/12662 describe un método de cribado de compuestos por la susceptibilidad a la excreción biliar, que comprende poner en contacto los compuestos con un cultivo en sándwich de hepatocitos de rata o porcinos introducidos en una matriz de agarosa y que comprende una red canalicular biliar funcional y determinar la cantidad de compuesto en la red canalicular biliar.

No se ha demostrado que los métodos existentes sean ampliamente aplicables para investigar la excreción biliar humana. Además, las estrategias existentes no se pueden utilizar para examinar de manera eficaz los procesos de excreción biliar para un gran número de fármacos candidatos. De este modo, existe una gran necesidad por un ensayo para valorar la susceptibilidad de compuestos candidatos para la captación hepática y la excreción biliar. Dicho análisis facilitaría la eliminación de aquellos compuestos con una susceptibilidad elevada no deseable por la excreción biliar de una posterior evaluación como agentes terapéuticos de manera precoz en el proceso de evaluación. De forma similar, existe una gran necesidad por la identificación rápida de compuestos candidatos adecuados (es decir, compuestos que no son susceptibles de la excreción biliar) para el ensayo posterior como agentes terapéuticos.

Descripción resumida de la invención

En la presente invención se describe un método de cribado de un compuesto candidato por la susceptibilidad a la excreción biliar según la reivindicación 1.

Por consiguiente, un objetivo de la presente invención es proporcionar un método rápido y económico de cribado de compuestos candidatos por la susceptibilidad a la excreción biliar.

Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un método in vitro de cribado de compuestos candidatos por la susceptibilidad a la excreción biliar.

Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un método de cribado de compuestos candidatos por la susceptibilidad a la excreción biliar que facilita el cribado de muchos compuestos candidatos en un único esfuerzo.

Otro objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un método de cribado...

1. Método de cribado de un compuesto candidato por la susceptibilidad a la excreción biliar, comprendiendo el método las etapas de:

(a) proporcionar un cultivo de hepatocitos, comprendiendo el cultivo por lo menos un canalículo biliar;

(b) exponer un compuesto candidato y una cantidad preseleccionada de un compuesto marcador al cultivo durante un tiempo suficiente para permitir la captación;

(c) lavar el cultivo; y

(d) detectar una cantidad de compuesto marcador presente en por lo menos un canalículo biliar en el cultivo, indicando la presencia o ausencia de una cantidad reducida del compuesto marcador en comparación con la cantidad preseleccionada del compuesto marcador la susceptibilidad del compuesto candidato a la excreción biliar.

2. Método según la reivindicación 1, en el que los hepatocitos se aíslan de una fuente seleccionada del grupo que consiste en rata, humano, mono, simio, gato, perro, cerdo, puerco, ganado vacuno, bueyes, ovejas, caballos, pavos, pollos, patos y gansos.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el cultivo de hepatocitos comprende además un cultivo a largo plazo de hepatocitos.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el cultivo de hepatocitos comprende además una red canalicular.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el cultivo de hepatocitos se caracteriza además por tener una configuración seleccionada del grupo que consiste en clusters de hepatocitos, agregados de hepatocitos, por lo menos una capa de hepatocitos, y combinaciones de los mismos.

6. Método según la reivindicación 5, en el que los hepatocitos están introducidos en una matriz.

7. Método según la reivindicación 5, en el que el cultivo de hepatocitos comprende además un cultivo en sándwich de hepatocitos, comprendiendo el cultivo en sándwich por lo menos una capa de hepatocitos y por lo menos un canalículo biliar con por lo menos dicha capa de hepatocitos.

8. Método según la reivindicación 7, en el que el cultivo en sándwich de hepatocitos comprende además un cultivo en sándwich a largo plazo de hepatocitos.

9. Método según la reivindicación 7, en el que por lo menos una capa de hepatocitos se encuentra en sándwich entre dos capas de la matriz.

10. Método según la reivindicación 9, en el que la matriz se selecciona del grupo que consiste en un medio de matriz biológica, un medio de matriz sintética y combinaciones de los mismos.

11. Método según la reivindicación 10, en el que el medio de la matriz biológica se selecciona del grupo que consiste en colágenos, lamininas, complejos derivados de membranas basales, derivados de los mismos y combinaciones de los mismos.

12. Método según la reivindicación 1, en el que las etapas (a) a (d) se llevan a cabo en por lo menos un pocillo de una placa con múltiples pocillos.

13. Método según la reivindicación 1, en el que el compuesto marcador se selecciona del grupo que consiste en un compuesto fluorogénico, un compuesto fluorescente, un compuesto quimioluminiscente, un compuesto colorimétrico, un compuesto radiomarcado y combinaciones de los mismos.

14. Método según la reivindicación 1, que comprende además cribar una pluralidad de compuestos candidatos simultáneamente por la susceptibilidad a la excreción biliar.