La presente invención describe un procedimiento para la determinción de la fragmentación del ADN en espermatozoides de animales.

Particularmente se refiere a un procedimiento para evaluar la inegridad de la cromatina/ADN de los espermatozoides mediante un tatamiento de la muestra con una solución desnaturalizante del AD seguida, opcionalmente de una tinción; un posterior tratamientocon una solución de lisis que no contiene detergente desnaturaliante de proteínas, seguida, opcionalmente de una tinción; y una valuación de la integridad de la eromatina/ADN. La presente inveción se refiere además a un kit para evaluar la calidad de los epermatozoides de animales que incluye una solución desnaturalizate del ADN y una solución de lisis que no contiene detergente dcnatucalizantc de proteínas

Procedimiento de determinación de la fragmentación del ADN en espermatozoides de animales.

Campo de la invención

Esta invención tiene su campo de aplicación dentro del sector sanitario, principalmente aquel relacionado con la biología de la reproducción, en especial está dirigida a procedimientos y métodos para la determinación de la calidad del semen en animales.

Antecedentes de la invención

En la actualidad el 6% de los varones de países occidentales, en edad fértil, presentan algún tipo de patología que les impide una reproducción normal. A este efecto, la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha conjuntado en un único protocolo una serie de procedimientos de laboratorio que estandardiza en el ámbito internacional el análisis de la calidad del semen. Estos estudios se centran en la determinación de la concentración, morfología (Ankem Murali K et al., "Novel assay for determining DAN organization in human spermatozoa: Implicatio for male factor infertility" Urology, vol. 59 nº 4, Abril 2002) y motilidad de los espermatozoides, complementada con la evaluación de ciertas pruebas funcionales, así como de determinados parámetros bioquímicos y enzimáticos (USA-5801058) del semen (WHO, 1999). Con este conjunto de pruebas se puede estimar el volumen total del mismo y la concentración de espermatozoides por mililitro y se puede diagnosticar si la infertilidad del varón es debida a una ausencia (azoospermia) o a una disminución clara (oligospermia) de la cantidad de espermatozoides en el eyaculado. Asimismo, se determina la posible existencia de problemas de motilidad (astenozoospermia) que imposibilita que estas células atraviesen la cavidad uterina y alcancen con éxito el tercio externo de las trompas de Falopio. También se analiza si presentan problemas graves de morfología de sus componentes (cabeza, cuello, cola) (teratozoospermia), dado que estas variaciones repercuten en la capacidad para una fertilización eficaz del óvulo femenino. Complementariamente, se explora igualmente la participación de glándulas tales como la próstata y las vesículas seminales (infecciones, agenesias). Por último, pruebas funcionales como la prueba HOS (permeabilidad iónica de membrana celular) o la capacidad de progresión de los espermatozoides in vitro, dan una idea de la capacidad fértil del semen. Finalmente, estos estudios de laboratorio precisan, ocasionalmente, completarse con perfiles hormonales, biopsia del testículo y/o la determinación del cariotipo (estudio cromosómico que define la condición heredada del sexo masculino o femenino de un individuo) y/o pruebas de genética molecular.

A pesar de los estudios clínicos y de laboratorio, la causa de la infertilidad no se puede determinar en alrededor del 30%-50% de los varones infértiles, en lo que se denomina infertilidad idiopática. Recientemente, se ha reconocido que el daño del ADN de los espermatozoides podría ser la explicación de un elevado porcentaje de estos casos idiopáticos (Evenson et al., 1999; Larson et al., 2000), de tal modo que el estudio de la fragmentación del ADN de los espermatozoides es un tema de investigación activa con publicaciones continuas en las revistas especializadas (Evenson et al., 2002). Anomalías de la cromatina, e incluso daño en el ADN nuclear de los espermatozoides, podría tener lugar o incluso ser el resultado de anomalías en el empaquetamiento del ADN que tienen lugar durante la espermiogénesis (Sailer et al., 1995). También cabe la posibilidad de que puedan ser el resultado de daño producido por radicales libres que provocan estrés oxidativo (Aitken et al., 1998), o consecuencia de un posible proceso de apoptosis (Gorczyca et al., 1993).

Existen diversos procedimientos para evaluar la integridad de la cromatina/ADN de los espermatozoides humanos. Entre ellos se destacan la ruptura de ADN in situ introduciendo nucleótidos marcados en el mismo utilizando enzimas tales como transferasa terminal (TUNEL) o ADN polimerasa (in situ nick translation ISNT) (Gorczyca et al., 1993). Estos procedimientos se basan en la utilización de enzimas sobre los espermatozoides fijados en portaobjetos. Por esta razón su eficacia no es muy alta, siendo accesibles para la enzima solamente aquellas roturas marcadas, lo cual conduce a una reproducibilidad relativamente baja de los resultados. Los reactivos también son costosos, por lo que estas técnicas sólo se utilizan en investigación, no siendo posible utilizarlas para la evaluación clínica del semen. Otra técnica es el ensayo de cometa (Hughes et al., 1996). Los espermatozoides se incluyen en un microgel de agarosa sobre un portaobjetos y se someten a soluciones de lisis para extraer las membranas y las proteínas. Se obtienen así nucleoides, es decir, núcleos desproteinizados, en los que las fibras de ADN se han desenrollado por estiramiento. Los nucleoides se someten a electroforesis en una cubeta rellena de solución tampón, de tal modo que las fibras de ADN migran hacia el ánodo, creando la imagen de un cometa, con una cabeza y una cola en la dirección de la migración electroforética. Estos cometas se tiñen con un colorante fluorescente, para ser observados mediante microscopía de fluorescencia. Si el núcleo presenta fragmentación del ADN, gran cantidad de fragmentos del mismo habrán migrado, y se habrán concentrado en la cola del cometa. Se trata de una prueba bastante sensible, pero relativamente costosa y complicada para un laboratorio clínico convencional. De hecho, requiere instrumental particularmente poco común: cubeta y transformador eléctrico de electroforesis, microscopía de fluorescencia, y un sistema de captación de las imágenes y de análisis de las mismas. Por todas estas razones no es aplicable al estudio clínico del semen y sólo se utiliza con fines de investigación.

La técnica de referencia actual para el estudio de la fragmentación del ADN de los espermatozoides es el ensayo de estructura de la cromatina de Evenson (SCSA: Sperm Chromatin Structure Assay; Evenson et al., 1980; 2000; Evenson y Jost, 1994). En esta técnica, los espermatozoides en suspensión se añaden a una solución desnaturalizante ácida. Aquellos espermatozoides sin roturas en su ADN son resistentes a esta desnaturalización ácida, permaneciendo como ADN de cadena doble. Sin embargo, los espermatozoides con ADN fragmentado sí desnaturalizan su ADN, transformándose en ADN de cadena sencilla. Posteriormente se tiñen con naranja de acridina. Esta tinción emite fluorescencia verde cuando se une al ADN de cadena doble. Sin embargo, en los espermatozoides con ADN desnaturalizado, en cadena simple, este fluorocromo emite fluorescencia roja. Los espermatozoides con ADN desnaturalizado se cuantifican utilizando citometría de flujo, para discriminar entre ambos tipos de fluorescencia. El SCSA es una técnica con gran proyección clínica, que ha sido evaluada en un gran número de pacientes. Utilizando este sistema, se ha establecido que cuando un individuo presenta el 30% o más de los espermatozoides con ADN fragmentado, su probabilidad de conseguir un embarazo que llegue a término es menor del 1%, y esto es aplicable a fecundación natural así como a reproducción asistida (Evenson et al., 1999; Larson et al., 2000).

El porcentaje de espermatozoides con ADN fragmentado puede ser más o menos constante en los diferentes ciclos espermatogénicos del individuo, pero también puede variar a consecuencia de factores exógenos, o por ejemplo tras un episodio febril intenso, como una gripe (Evenson et al., 2000). De este modo se pueden hacer estudios seriados, seleccionando aquellas muestras con menor nivel de fragmentación, para ser utilizadas posteriormente en las técnicas de reproducción asistida. Es importante tener en cuenta que la congelación de las muestras de semen en nitrógeno líquido no modifica los niveles de fragmentación del ADN, por lo que se puede realizar esta prueba sobre muestras congeladas, que después se pueden utilizar en inseminación, FIV (fecundación in vitro) o ICSI (Inyección Intracitoplasmática de Espermatozoides). Esto supone una gran ventaja operativa para el paciente y para el laboratorio.

La técnica SCSA, aunque robusta y altamente reproducible, es un sistema costoso, difícil de implementar, y no muy accesible para el laboratorio básico (De Jonge, 2002). Por estas razones, la calidad del ADN de los espermatozoides todavía no se puede evaluar rutinariamente, a pesar de su contrastado valor clínico en el estudio de la infertilidad.

Recientemente, el grupo de investigación de los autores de la presente describió de modo...

1. Procedimiento para evaluar la integridad de la cromatina/ADN y de los espermatozoides de un animal que comprende:

2. Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque el detergente no iónico se selecciona entre el grupo toctilfenoxipolietoxietanol (Triton-X100), N,N-bis(3-D-gluconamidopropil) colamida (bigCHAP), Brij(r) 35 P, N-decanoil-N-metilglucamina, digitonin, dodecanoyl-N-metilglucamida, heptanoil-N-metilglucamida, octilfenoxi poly(etileneoxi)etanol ramificado (Igepal CA-630), N-Nonanoil-N-metilglucamina, Nonidet P 40, N-Octanoil-N-metilglucamina, solución Span 20, polisorbato 20 (Tween 20) y sus mezclas, preferentemente Triton-X 100.

3. Un procedimiento según las reivindicaciones 1-2 caracterizado porque la solución de lisis comprende cloruro sódico entre 1 y 3 M, ditiotreitol (DTT) entre 0,001 y 2M, 2-amino-2 (hidroximetil)-1,3-propanodiol (Tris) entre 0,001 M y 2 M y Triton X-100 entre 0,1% y 3%.

4. Procedimiento según las reivindicaciones 1-3 caracterizado porque la solución de lisis comprende cloruro sódico 2,5 M, DTT 0,2 M, Tris 0,2 M, Triton-X 1% y pH de 7,5.

5. Procedimiento según las reivindicaciones 1-4 caracterizado porque la solución desnaturalizante del ADN es ácida.

6. Procedimiento según la reivindicación 5 caracterizado porque la solución desnaturalizante del ADN comprende un ácido seleccionado entre el grupo ácido clorhídrico, acético, nítrico o mezclas de éstos.

7. Procedimiento según la reivindicación 6 caracterizado porque la solución desnaturalizante del ADN comprende ácido clorhídrico.

8. Procedimiento según las reivindicaciones 1-7 caracterizado porque después de las etapas a) y b) hay una etapa de tinción de la muestra.

9. Procedimiento según la reivindicación 8 caracterizado porque la tinción se hace con una solución tipo Wright.

10. Procedimiento según las reivindicaciones 1-9 caracterizado porque la muestra que contiene los espermatozoides se incluye en un medio similar a una suspensión, preferentemente en un microgel.

11. Procedimiento según la reivindicación 10 caracterizado porque la muestra que contiene los espermatozoides se incluye en un microgel de agarosa.

12. Uso de una solución desnaturalizante del ADN y una solución de lisis en el procedimiento de la reivindicación 1, en el que el detergente que está comprendido en dicha la solución de lisis es un detergente no iónico, no desnaturalizante de proteínas.

13. Uso, según la reivindicación 12, caracterizado porque la solución de lisis comprende cloruro sódico entre 1 M y 3 M, ditiotreitol (DTT) entre 0,001 M y 2 M, 2-amino-2 (hidroximetil)-1,3-propanodiol (Tris) entre 0,001 M y 2 M y Triton X-100 entre 0,1% y 3%.