DESACTIVACION GENICA DEL FACTOR DE TRANSCRIPCION PNTR Y SUS UTILIZACIONES.

Constructo de ácido nucleico dispuesto para reducir la expresión o función del factor de transcripción regulador de la pentosa (PntR);

en el que dicho constructo de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un PntR funcionalmente alterado, y en el que dicho constructo de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica al PntR y que carece de la región que codifica a Zn2Cys6

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/IB2005/003600.

Solicitante: DANISCO A/S.

Nacionalidad solicitante: Dinamarca.

Dirección: LANGEBROGADE 1, P.O. BOX 17,1001 COPENHAGEN K.

Inventor/es: MADRID, SUSAN MAMPUSTI, NIKOLAEV,IGOR.

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 31 de Marzo de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K14/38 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de Aspergillus.
  • C12N15/80 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › para hongos.

Clasificación PCT:

  • C07K14/37 C07K 14/00 […] › de hongos.
  • C12N1/15 C12N […] › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N1/21 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/63 C12N 15/00 […] › Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión.
  • C12N15/80 C12N 15/00 […] › para hongos.
  • C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.

Fragmento de la descripción:

Desactivación génica del factor de transcripción PntR y sus utilizaciones.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a constructos de ácido nucleico dispuestos para reducir la expresión o la función del factor de transcripción regulador de la pentosa (PntR); en los que dichos constructos de ácido nucleico comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica un PntR funcionalmente alterado, y en los que dichos constructos de ácido nucleico comprenden una secuencia de ácido nucleico que codifica al PntR y que carece de la región que codifica a Zn2Cys6.

La invención se refiere asimismo a plásmidos, vectores y células hospedadoras, que comprenden los constructos de ácido nucleico; y a los procedimientos de producción.

Además, la invención se refiere a los procedimientos que conllevan la reducción de la producción o a la función del factor de transcripción PntR y a las células hospedadoras útiles para la expresión y producción de proteínas de interés, en los que se ha reducido la producción o función del factor de transcripción PntR.

Antecedentes de la técnica y técnica anterior

Los hongos filamentosos son conocidos por su capacidad para producir una extensa gama de diferentes metabolitos y, en particular, enzimas segregadas con varias aplicaciones industriales que incluyen el abastecimiento de productos terapéuticos o para su utilización en la industria de la panificación.

Antes del desarrollo de los sistemas de transformación de hongos, la mejora de las cepas de producción se limitó en gran medida a una estrategia basada en la mutagénesis clásica seguida del cribado de un fenotipo o a la actividad enzimática deseada y la selección de la mejor cepa productora.

Comercialmente, los hongos filamentosos han llegado a utilizarse actualmente ampliamente como sistemas de células hospedadoras para la producción tanto de proteínas homólogas como heterólogas y hasta la fecha, varias estrategias moleculares y genéticas se han aplicado con éxito para optimizar hongos filamentosos, en particular los del género Aspergilli, como fábrica de células.

En muchos casos, estas estrategias han conducido a elevados rendimientos tanto de proteínas homólogas como heterólogas, y sustancialmente redujeron el tiempo requerido para la realización de un nuevo proceso de producción a gran escala.

Sin embargo, continúa existiendo la necesidad de procedimientos mejorados.

Los hongos filamentosos son productores de enzimas celulolíticas y hemicelulolíticas muy conocidos. El sistema de degradación de celulasa de estos organismos está constituido por tres clases de enzimas, endoglucanasas, celobiohidrolasas y beta-glucosidasas. Los xilanos son polímeros heterogéneos de hemicelulosa, que requieren una serie más compleja de enzimas para su degradación. Estas enzimas, clasificadas extensamente como xilanasas, incluyendo endoxilanasa, beta-xilosidasa, acetilxilan-esterasa, a-L-arabinofuranosidasa, arabinoxilan-arabinofuranohidrolasa, beta-glucuronidasa, feruloil-esterasa y p-cumaroil-esterasa (figura 15).

La expresión de las enzimas degradadoras de celulosa y xilano por las especies Aspergillus y Trichoderma está regulada a nivel de transcripción. Sin embargo, los mecanismos de represión e inducción todavía no se han aclarado completamente.

El factor de transcripción xlnR se clonó originalmente en el hongo filamentoso A. niger y se identificó como un activador de transcripción de los genes que codifican la xilanasa (documento WO 97/00962). De hecho, se ha demostrado que activa la transcripción de una extensa serie de genes implicados en la degradación de la celulosa y hemicelulosas en numerosas especies de hongos. Basándose en su estructura, el XlnR se ha asignado a una familia de factores de transcripción de hongos, cuyo dominio de unión al ADN está compuesto por 6 residuos de cisteína conservados que quelan dos átomos de Zn, un grupo denominado binuclear de Zn.

Se han clonado homólogos de xlnR de varios Aspergilli (A. nidulans, A. oryzae, A. kawachii, A. tubingensis, A. flavus), así como de otros hongos, como Hepocrea jecorina (anamorf: T. reesei). Además, pueden encontrarse secuencias similares en muchas bases de datos del genoma de hongos de acceso público, tales como Aspergillus fumigatus, Neurospora crassa, Magnaporthe grísea, Podospora anserina, Fusarium grameniarum. Aunque la homología global entre diferentes especies oscila en el intervalo entre 50 y 90%, presenta casi 100% de identidad en el dominio de unión del ADN que comprende un grupo de seis restos de cisteína en la parte terminal N de la proteína. En particular, un tramo de restos de aa entre la segunda y tercera cisteínas representado por la secuencia NQLRTK está sumamente conservado. En general, esta secuencia determina la especificidad de unión del ADN de una proteína del grupo binuclear Zn2Cys6, que, en el caso del XlnR, reconoce un ADN diana afín con el núcleo de consenso 5' GGCTAR 3' (de Vries y Visser, 2001; Microbiol. Mol. Biol. Reviews v65: 497-522). Por consiguiente, pudo predecirse que todos estos homólogos desempeñan una función que es la regulación de la transcripción de los genes relacionados con la degradación del xilano.

Posteriormente, se han realizado varias estrategias para mejorar la producción de proteínas de interés (POI) utilizando células hospedadoras recombinantes procedentes de hongos filamentosos.

La estrategia más sencilla para mejorar el rendimiento de las proteínas homólogas y heterólogas documentada en la bibliografía consiste en introducir múltiples copias de un gen estructural de interés (véase, por ejemplo, Hessing et al., 1994). Sin embargo, ésta puede que no conduzca siempre a la sobreexpresión del gen de interés. La concentración de una proteína de interés en la célula micótica ha aumentado también expresándola en un promotor potente (Mathieu y Felenbok, 1994; Nikolaev et al., 2002; Rose y Van Zyl, 2002).

La transcripción del sistema xilanolítico y celulolítico y, como consecuencia, la producción enzimática total por Aspergillus niger podría mejorarse aumentando el número de copias de genes de xlnR (Gielkens et al., 1999). Por el contrario, la inactivación de xlnR por la alteración génica conduce a la pérdida de transcripción de los genes xilanolíticos extracelulares.

Otra estrategia conlleva una modificación de la región del promotor del gen de interés mediante la mutación de puntos de fijación de un factor de transcripción. La actividad del promotor del gen xynF1 de Aspergillus oryzae, controlado por la actividad de ß-galactosidasa, fue regulada por incremento con éxito mutando dos zonas de fijación del XlnR no canónicas a una secuencia, que se supone que tiene una afinidad de fijación mayor (Marui et al., 2003). Los transformados portadores de tres secuencias de fijación del XlnR canónicas en la región del promotor de xynF1 produjeron 2,8 veces más enzimas que aquellas que tienen el promotor auténtico.

Muchos de los genes implicados en el metabolismo del carbono están sometidos a la represión del carbono mediada por el represor global CreA. De hecho, CreA controla la expresión génica a varios niveles y puede reprimir tanto un gen estructural como regulador. La eliminación o mutación de las zonas de fijación de CreA en los promotores correspondientes produce la desrepresión parcial de la transcripción y producción de la proteína mejorada (Orejas et al., 1999). Se obtuvo una mejora adicional en un historial desreprimido de CreA (Prathumpai et al., 2004).

En los Aspergilli, D-xilosa actúa como inductor de los genes xilanolíticos (de Vries et al. 1999; Gouka et al., 1996). Además, la producción de xilanasa parecía mejorarse tanto en el cultivo de T. reesei (Xiong et al., 2004) como de Penicillium canescens (Vavilova et al., 2003) en un medio que contiene L-arabinosa.

El análisis para control metabólico y la ingeniería de la serie de reacciones metabólicas son otros medios útiles de mejora de la cepa. Se ha demostrado que el control del flujo del metabolismo de la xilosa se ejerce en las dos primeras etapas (Prathumpai et al., 2003). La alteración de uno de los genes responsables de la reducción de D-xilosa produjo un aumento de la transcripción...

 


Reivindicaciones:

1. Constructo de ácido nucleico dispuesto para reducir la expresión o función del factor de transcripción regulador de la pentosa (PntR); en el que dicho constructo de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un PntR funcionalmente alterado, y en el que dicho constructo de ácido nucleico comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica al PntR y que carece de la región que codifica a Zn2Cys6.

2. Constructo de ácido nucleico según la reivindicación 1, que comprende la totalidad o un fragmento eficaz de una secuencia de ácido nucleico de cualquiera de las siguientes:

a) una secuencia aislada de ácido nucleico que codifica un factor de transcripción PntR que comprende una secuencia nucleotídica que es la misma que, o es complementaria de, o contiene cualesquiera sustituciones en el codón adecuadas para cualquiera dé las de SEC. ID. nº 1, nº 3 o nº 5 o comprende una secuencia que presenta por lo menos 60% de homología de secuencia con cualquiera de las SEC ID nº 1, nº 3 o nº 5;
b) una secuencia aislada de ácido nucleico según a) que codifica un polipéptido del factor de transcripción PntR que comprende la secuencia de aminoácidos representada en cualquiera de las SEC. ID. nº 2, nº 4 o nº 6 o una secuencia que presenta por lo menos 75% de identidad a éstas;
c) una secuencia aislada de ácido nucleico según b) que se obtiene a partir de una célula de Aspergillus, Trichoderma o Penicillium-, y
d) una secuencia aislada de ácido nucleico según c) que se obtiene a partir de una célula de Aspergillus.

3. Plásmido o sistema de vector que comprende un constructo de ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2.

4. Procedimiento de alteración de la expresión de PntR en una célula que comprende introducir un constructo de ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2 o un plásmido o sistema de vector según la reivindicación 3 en dicha célula.

5. Célula hospedadora transformada o transfectada con un constructo de ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2 o un plásmido o sistema de vector según la reivindicación 3.

6. Célula hospedadora según la reivindicación 5, que comprende además un constructo de ácido nucleico que comprende una secuencia de codificación de una proteína de interés (POI) bajo el control de la transcripción de un promotor regulado por el XlnR.

7. Célula hospedadora según la reivindicación 5 ó 6, en la que dicha célula hospedadora se selecciona de entre el grupo constituido por Aspergillus sp., Trichoderma y Penicillium sp.

8. Célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, que puede producir una xilanasa extracelular.

9. Célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en la que dicha célula es deficiente en proteasa.

10. Célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, en la que dicha célula presenta un bloque en el metabolismo de L-arabinosa.

11. Célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 10, en la que dicha célula presenta una actividad de xilanasa aumentada.

12. Célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 11, en la que dicha célula resulta útil para la producción de una POI.

13. Procedimiento de expresión en una célula hospedadora de una POI cuya secuencia de codificación está bajo el control de transcripción de un promotor regulado por el XlnR, comprendiendo dicho procedimiento reducir la expresión o actividad del factor de transcripción PntR en dicha célula hospedadora; en el que dicho procedimiento comprende utilizar una célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, que comprende las etapas que consisten en proporcionar una célula hospedadora deficiente en PntR que comprende el gen que codifica la POI bajo control transcripcional del XlnR y cultivar la célula hospedadora en condiciones apropiadas.

15. Procedimiento según la reivindicación 13 ó 14, en el que el PntR presenta una secuencia de ácido nucleico como se expone en cualquiera de las SEC. ID. nº 1, nº 3 o nº 5 o una secuencia que presenta más de 60% de identidad a éstas.

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que la POI es una POI cuya secuencia de codificación está naturalmente bajo control transcripcional de un promotor regulado por el XlnR en una célula madre de la célula hospedadora.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que la POI es una POI cuya secuencia de codificación no está naturalmente bajo control transcripcional de un promotor regulado por el XlnR en una célula madre de la célula hospedadora.

18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, en el que la célula hospedadora es una célula fúngica filamentosa.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que dicha célula hospedadora es una célula hospedadora de Aspergillus, Trichoderma y Penicillium spp.

20. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19, en el que dicho procedimiento de expresión de POI forma parte de un procedimiento de producción de dicha POI y comprende además aislar/purificar dicha POI.

21. Procedimiento de producción de una POI, que comprende la expresión en una célula hospedadora de una POI cuya secuencia de codificación está bajo el control transcripcional de un promotor regulado por el XlnR, comprendiendo dicho procedimiento reducir la expresión o la actividad del factor de transcripción PntR en dicha célula hospedadora; en el que dicha célula hospedadora es una célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12.

22. Utilización de la reducción en la expresión o la actividad del factor de transcripción PntR en la preparación de una célula hospedadora para aumentar la expresión de una proteína de interés (POI) cuya secuencia de codificación está bajo el control transcripcional de un promotor regulado por el XlnR; en la que se utiliza un constructo de ácido nucleico según la reivindicación 1 ó 2 en la preparación de la célula hospedadora.

23. Utilización de una célula hospedadora según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12 para la preparación de un producto alimenticio.


 

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