Uso de un antibiótico específico para P1H12 para preparar una población enriquecida de células madre por medio de selección positiva a partir de una población original de células,

siendo dichas células madre capaces de dar lugar a células endoteliales y/o de tipo endotelial

Células madre endoteliales, poblaciones, métodos de aislamiento y uso de las mismas.

Esta solicitud reivindica como prioridad a la solicitud provisional No. 60/343.498, presentada el 21 de diciembre de 2001.

Campo de la invención

La presente invención proporciona células madre caracterizadas por tener la habilidad para renovar y la habilidad para dar lugar a células endoteliales o de tipo endotelial, métodos para aislar tales células madre y métodos para utilización de las mismas. También proporciona células de la progenie derivadas de las células madre de la invención.

Antecedentes de la invención

El cuerpo de los mamíferos está compuesto de diferentes células comprometidas con el linaje que dan lugar a muchos de los tejidos del cuerpo de los mamíferos. A pesar de la diversidad de la naturaleza, morfología, características y función de tales células comprometidas con el linaje, actualmente se cree que la mayoría, si no todas, las células comprometidas con el linaje se derivan de diferentes células madre que dan lugar a una o más de las células comprometidas con el linaje del cuerpo de los mamíferos. Tales células madre constituyen únicamente un pequeño porcentaje del número total de células presentes en el cuerpo y pueden variar dependiendo de su compromiso relativo con un tipo particular de célula. Además, no se sabe qué marcadores asociados con las células comprometidas con el linaje están también presentes en las células madre. Un marcador que ha sido identificado como presente en las células madre, CD34, también se encuentra en un número significativo de progenitores comprometidos con el linaje (Asahara y colaboradores, 1997, Science, 275: 964). En particular, las células B (CD19⁺) y las células mieloides (CD33⁺) constituyen del 80 al 90% de la población de CD34⁺. Además, estará presente una combinación de CD3, 8, 10, 15, 19, 20 y 33 sobre más del 90% de todas las células CD34⁺. Por lo tanto, en vista de la pequeña proporción del número total de células en la médula ósea que son células madre, la incertidumbre de los marcadores asociados con las células madre a diferencia de las células más diferenciadas, y la inhabilidad general para hacer ensayos biológicos con células madre humanas, ha sido esquiva la identificación y purificación de células madre.

Las células endoteliales son una unidad celular organizacional de estructuras vasculares. Se requiere su compromiso lineal, expansión y montaje en vasos sanguíneos para organogénesis durante el desarrollo embrionario. Durante la angiogénesis, las células endoteliales en vasos existentes son activadas por factores de angiogénesis tales como TGF, FGF, y VEGF. Se forman nuevos vasos a través de la proliferación y migración de células, y del alargamiento y ramificación de los vasos existentes.

Se requiere la identificación de una fuente fácilmente disponible de células madre que pueda dar lugar a células endoteliales. La necesidad es particularmente aguda para células madre de fuentes de adultos, en vista de las restricciones recientemente colocadas para el uso de fondos federales para investigación sobre células madre embrionarias. La posesión de tales células madre permitirá la identificación de factores de crecimiento asociados con la regeneración de células endoteliales. Además, pueden existir aún factores de crecimiento no descubiertos u otros factores biológicos (por ejemplo, factores de transcripción) asociados con las primeras etapas de la dedicación de las células madre a un linaje de células endoteliales, la prevención de tal dedicación, y el control negativo de la proliferación de las células madre. La disponibilidad de las células madre sería extremadamente útil en trasplantes vasculares, ingeniería de tejidos, regulación de la angiogénesis, vasculogénesis, y la prevención de la misma. Las células madre y su progenie pueden encontrar uso en el tratamiento del daño y reparación del miocardio. Tales células madre también podrían ser utilizadas para introducir un gen en un individuo como parte de un régimen de terapia génica.

Resumen de la invención

En una modalidad, la presente invención proporciona un método para preparar una población enriquecida de células madre, que comprende la separación de dicha población enriquecida de células madre a partir de una primera población de células, en donde dicha población enriquecida de células madre incluye al menos aproximadamente una concentración 100 veces mayor de células madre P1H12+ que dicha primera población de células. En otra modalidad, dicha población enriquecida de células madre incluye una concentración aproximadamente de 1.000 hasta aproximadamente 4.000 veces mayor de células madre P1H12+ que dicha primera población de células. En otra modalidad, dicha población enriquecida de células madre incluye además entre una concentración superior a dicha primera población de células de uno o más de los marcadores seleccionados del grupo que consiste de CD148, AC133, CD45 y CD34. En otra modalidad, dicha etapa de separación incluye poner en contacto dicha primera población de células con una molécula que específicamente se enlaza a P1H12+ y seleccionar dicha población enriquecida de células que está enlazada a dicha molécula. En otra modalidad, dicha molécula es un anticuerpo. En otra modalidad, dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En otra modalidad, dicha molécula se deriva de un anticuerpo. En otra modalidad, dicha molécula es una molécula de fusión péptido-Fc. En otra modalidad, dicha etapa de separación incluye además poner en contacto dicha primera población de células con una molécula que específicamente se enlaza a una molécula seleccionada del grupo que consiste de CD148, AC133, CD45 y CD34 y seleccionar dicha población enriquecida de células que está enlazada a dicha molécula. En otra modalidad, dicha etapa de separación incluye además poner en contacto dicha población enriquecida de células con una molécula que específicamente se enlaza con un marcador seleccionado del grupo que consiste de CD148, AC133, CD45 y CD34 y remover de dicha población enriquecida de células a las células que no están enlazadas a dicha molécula. En otra modalidad, dicha etapa de separación incluye además poner en contacto dicha primera población de células con una molécula que específicamente se enlaza a una molécula seleccionada del grupo que consiste de CD144, CD202b, VEGFR2 y seleccionar de dicha población enriquecida de células a las células que no están enlazadas a dicha molécula. En otra modalidad, dicha etapa de separación incluye además poner en contacto dicha población enriquecida de células con una molécula que específicamente se enlaza a una molécula seleccionada del grupo que consiste de CD144, CD202b, VEGFR2 y remover de dicha población enriquecida de células, las células que están enlazadas a dicha molécula. En otra modalidad, dicha población enriquecida de células madre incluye al menos una población aproximadamente 100 veces mayor de células madre que son P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- o VEGFR2- que dicha primera población de células. En otra modalidad, dicha población enriquecida de células madre incluye una concentración aproximadamente al menos 1.000 veces superior de células madre que son P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- o VEGFR2- que dicha primera población de células. En otra modalidad, dicha población enriquecida de células madre incluye una concentración aproximadamente al menos 1.000 veces hasta aproximadamente 4.000 veces superior de células madre que son P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- o VEGFR2- que dicha primera población de células. En otra modalidad, dicha población enriquecida de células madre está enriquecida adicionalmente con células madre que son CD34+ o CD45+. En otra modalidad, dicha población enriquecida de células madre está enriquecida adicionalmente con células madre que son CD34- y CD45+. En otra modalidad, dicha población enriquecida de células madre está enriquecida adicionalmente con células madre que son CD34+ y CD45+. En otra modalidad, dicha molécula está enlazada a una entidad detectable. En otra modalidad, dicha entidad detectable es una entidad fluorescente, una entidad colorimétrica, o una entidad magnética. En otra modalidad, dicha molécula está enlazada a un sustrato sólido. En otra modalidad, dicho sustrato sólido es una superficie plástica, una superficie de vidrio, agarosa, acrilamida, lectina o una partícula magnética. En otra modalidad, dicho método comprende además la etapa de cultivar dicha población enriquecida de células...

1. Uso de un antibiótico específico para P1H12 para preparar una población enriquecida de células madre por medio de selección positiva a partir de una población original de células, siendo dichas células madre capaces de dar lugar a células endoteliales y/o de tipo endotelial.

2. El uso de la reivindicación 1, en donde dicha población enriquecida de células madre incluye una concentración al menos aproximadamente 100 veces superior de células madre P1H12+ que dicha población original de células.

3. El uso de la reivindicación 1, en donde dicha población enriquecida de células madre incluye una concentración al menos aproximadamente 1.000 veces superior de células madre P1H12+ que dicha población original de células.

4. El uso de la reivindicación 1, en donde dicha población enriquecida de células madre incluye una concentración aproximadamente desde 1.000 veces hasta aproximadamente 4.000 veces superior de células madre P1H12+ que dicha población original de células.

5. El uso de la reivindicación 1, en donde dicha población enriquecida de células madre incluye además una concentración superior que dicha población original de células de uno o más de los marcadores seleccionados del grupo que consiste de CD148, AC133, CD45 y CD34.

6. El uso de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

7. El uso de la reivindicación 1, en donde dicho enriquecimiento comprende:

8. El uso de la reivindicación 1, en donde dicha población enriquecida de células madre incluye una concentración al menos aproximadamente 100 veces superior de células madre que son P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- o VEGFR2- que dicha primera población de células.

9. El uso de la reivindicación 8, en donde dicha población enriquecida de células madre incluye una concentración al menos aproximadamente 1.000 veces superior de células madre que son P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- o VEGFR2- que dicha primera población de células.

10. El uso de la reivindicación 9, en donde dicha población enriquecida de células madre incluye una concentración aproximadamente desde 1.000 veces hasta aproximadamente 4.000 veces superior de células madre que son P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- o VEGFR2- que dicha primera población de células.

11. El uso de la reivindicación 8, en donde dicha población enriquecida de células madre es:

12. El uso de la reivindicación 1, en donde dicho anticuerpo está enlazado a una entidad detectable o a un sustrato sólido.

13. El uso de la reivindicación 12, en donde dicha entidad detectable es una entidad fluorescente, una entidad colorimétrica, o una entidad magnética.

14. El uso de la reivindicación 12, en donde dicho sustrato sólido es una superficie plástica, una superficie de vidrio, agarosa, acrilamida, lectina o una partícula magnética.

15. El uso de la reivindicación 1, en donde dicha primera población de células se deriva de un mamífero.

16. El uso de la reivindicación 15, en donde dicho mamífero es un primate.

17. El uso de la reivindicación 16, en donde dicho primate es un humano.

18. El uso de la reivindicación 1, en donde dicha población original de células se deriva de sangre periférica, médula ósea o tejido de hígado fetal.

19. Una población enriquecida de células madre que incluye una concentración al menos aproximadamente 100 veces superior de células madre en comparación con una población original de células, y que son P1H12+, CD148+, AC133+, CD144-, CD202b- o VEGFR2- y son CD34+ o CD45+, en donde dichas células madre pueden dar lugar a células endoteliales y/o de tipo endotelial.

20. Una población de células de la progenie derivadas de la población enriquecida de células madre de la reivindicación 19, en donde dichas células de la progenie son P1H12+, CD144+, AC133-, CD202+, CD45-, VEGFR2+, tienen una capacidad proliferativa mayor que las HUVEC y las MVEC, y contienen Cuerpos de Weibel-Palade.

21. La población enriquecida de células madre de la reivindicación 19 ó 20 ó la población de células de la progenie de la reivindicación 21 para uso en terapia.

22. La población enriquecida de células madre o la población de células de la progenie de la reivindicación 21 para el uso especificado allí, en donde la terapia es el tratamiento de una enfermedad o trastorno vascular o circulatorio, o tiene por objeto la regeneración o reparación de tejidos.