CONSTRUCTOS DE TRASPLANTE TISULAR PREVASCULARIZADOS PARA LA RECONSTRUCCIÓN DE UN ÓRGANO HUMANO O ANIMAL.

Procedimiento de fabricación de un constructo de trasplante tisular para reconstruir un órgano humano o animal,

en el que el constructo de trasplante tisular consta de una membrana y células células endoteliales microvasculares, comprendiendo los pasos de (a) aislar células endoteliales microvasculares dermales o células endoteliales de vejiga microvasculares; (b) aplicar las células endoteliales microvasculares sobre una membrana acelular biológicamente compatible; (c) cultivar bajo inducción estromal o bajo inducción epitelial-estromal las células endoteliales microvasculares que se han aplicado sobre la membrana acelular biológicamente compatible, para formar en la membrana estructuras microvasculares consistentes en células endoteliales microvasculares

La invención concierne a constructos de trasplante tisular para la reconstrucción de un órgano humano o animal, a un procedimiento para fabricar un constructo de trasplante tisular de esta clase y a usos del constructo de trasplante tisular. La invención concierne especialmente a un constructo de trasplante tisular para la reconstrucción de los órganos urológicos inferiores y especialmente de la vejiga de la orina.

El objetivo de la arquitectura tisular (“tissue engineering”) es la sustitución de tejido corporal dañado, lesionado o faltante por un material protésico biológicamente compatible. Actualmente, para acelerar la regeneración de tejidos, se investigan en la arquitectura tisular tanto la técnica de revestimiento celular como la técnica sin revestimiento celular (Alberti et al., 2004). La técnica de revestimiento celular (o arquitectura tisular celular) utiliza membranas biológicamente degradables que se han revestido in vitro con células primariamente cultivadas, habiéndose obtenido las células por medio de una biopsia de tejido huésped nativo. Este trasplante compuesto se pone después en el huésped para proseguir el proceso regenerativo. La técnica sin revestimiento celular comprende el emplazamiento directo in vivo de un material biológicamente degradable no revestido en el huésped, el cual deberá funcionar entonces como armazón para que pueda tener lugar el proceso de regeneración natural in vivo. Estas técnicas fomentan una regeneración tisular que se asemeja al desarrollo embrionario normal del órgano de interés.

Los materiales biológicos acelulares muestran buenos resultados en la generación tisular in vivo como membranas revestidas con células y no revestidas con células (Atala et al., 2000). En realidad, estos materiales biológicamente degradables se han empleado en la arquitectura tisular de órganos diferentes como un material natural, degradable y poroso y son conocidos por proporcionar in vitro señales biológicamente específicas para la interacción molecular con las células cultivadas y, además, para interaccionar con las células del tejido diana después de la implantación.

Sin embargo, cuando ya se ha implantado el trasplante en el huésped, la capacidad de mantener vivas las células que han crecido in vitro sobre la superficie o dentro de la matriz (técnica de revestimiento celular) o que se infiltran en la matriz después de la implantación (técnica sin revestimiento celular) constituye un obstáculo crítico. Se ha visto que un trozo del tejido con un volumen que sobrepase unos pocos milímetros cúbicos no puede sobrevivir por difusión de nutrientes, sino que requiere la presencia de capilares sanguíneos para la alimentación de nutrientes importantes y oxígeno (Mooney et al., 1999). Por tanto, la vascularización retardada puede ocasionar un fallo del implante. Hasta hoy, los éxitos de las técnicas de implantación se han limitado a estructuras relativamente delgadas o avasculares (por ejemplo, piel y cartílago), en donde la formación de vasos por el huésped después de la implantación es suficiente para satisfacer los requisitos del implante en materia de oxígeno y nutrientes (Jam et al., 2005). La vascularización sigue siendo un obstáculo crítico para el desarrollo de órganos más gruesos y metabólicamente exigentes, tales como el corazón, el cerebro y la vejiga de la orina.

La capacidad de prevascularización de armazones tisulares es una estrategia en principio terapéutica y supone un paso significativo en la técnica tisular debido a que se evita una regeneración tisular restringida. Una matriz prevascularizada acelera su vascularización y mejora su riego sanguíneo y su supervivencia in vivo. Los tejidos y órganos especialmente complejos necesitan un abastecimiento vascular para garantizar la supervivencia del trasplante y para hacer que los órganos bioartificiales sean capaces de funcionar (Mertsching et al., 2005). Un método de neovascularización es la formación de vasos nuevos a partir de células endoteliales. Este procedimiento, que se denomina vasculogénesis (formación de vasos), tiene lugar normalmente durante el desarrollo embrionario al formar órganos (Risau et al., 1995).

Es de especial importante la prevascularización de materiales para la reconstrucción de las vías urinarias inferiores (vejiga de la orina, uréter y uretra). Estos órganos presentan un rico abastecimiento a través de vasos sanguíneos. En la técnica de revestimiento celular de la arquitectura tisular de los órganos urinarios inferiores los ensayos se han limitado hasta ahora únicamente al cultivo de células uroteliales y células musculares (Alberti et al., 2004) sobre membranas biológicas. Estas células pueden cosecharse fácilmente en pequeñas biopsias de la vejiga.

La cuestión abierta es actualmente qué clase de células endoteliales pueden emplearse para la prevascularización de armazones biológicos que deben implantarse in vivo. Es sabido que los fenotipos de células endoteliales varían fuertemente en función del tipo de vaso y del órgano y que esta especifidad tisular juega un papel importante en la fisiología local de los órganos (Jam et al., 2005).

Schultheiss et al. describen en “Biological vascularized matrix for bladder tissue engineering: matrix preparation, reseeding technique and short-term implantation in a porcine model”, J. Urol. Enero de 2005; 173 (1): 276-80, una matriz acelular biológica que está colonizada con células de músculo liso, células uroteliales y células precursoras endoteliales. Las células precursoras se han obtenido a partir de fracciones de glóbulos sanguíneos. Para fabricar un constructo de trasplante tisular se reviste la matriz con células precursoras endoteliales procedentes de la sangre, además de revestirla con células de músculo liso y células uroteliales. Sin embargo, estas células no están en condiciones de formar estructuras vasculares en la matriz. Además, las células precursoras endoteliales no son específicas de los órganos. Por otra parte, no son células endoteliales maduras.

El cometido de la invención consiste en eliminar los inconvenientes según el estado de la técnica. Se pretende indicar especialmente un constructo de trasplante tisular que, en el caso de un revestimiento de la membrana con células endoteliales (y la formación de estructuras vasculares dentro de la membrana), haga posible una generación rápida y mejor del tejido circundante en el armazón después de la implantación o que, en el caso de un revestimiento de la membrana con células endoteliales y con otras células específicas de órganos (como células uroteliales, células musculares y/o células intersticiales), haga posible un mejor abastecimiento de las células contenidas en ella después de la implantación.

Este problema se resuelve con las características de las reivindicaciones 1 y 7. Ejecuciones convenientes de la invención se desprenden de las características de las reivindicaciones subordinadas.

El documento US 2004/0006395 A1 describe una membrana que está colonizada exclusivamente con células endoteliales, pero en la que no están formadas estructuras microvasculares, ya que las células endoteliales no penetran en la membrana; o (ii) una membrana que está colonizada con células endoteliales y otras células (células de músculo liso y células 3T3) y en la que están formadas estructuras microvasculares.

Velazquez Omaida C et al. (Database Biosis [Online] Biosciences Information Service, Filadelfia, PA, US, Agosto de 2002 (08-2002), “Fibroblast-dependent differentiation of human microvascular entothelial cells into capillary-like 3dimensional networks” (No de acceso a banco de datos PREV200200441299), revelan que se recubren células endoteliales con colágeno humano I y con una segunda capa de colágeno con fibroblastos incrustados para formar redes tridimensionales similares a capilares.

Hopkins Richard et al. (www.oulo.fi) revelan un método para acelerar la proliferación de células HUVEC sobre colágeno reticulado con ayuda de células madre de médula ósea mesenquimales y fibroblastos dermales.

El documento US 2001/051824 A1 presenta una membrana que ha sido colonizada con miofibroblasto. El cultivo de los miofibroblastos se efectúa en condiciones de flujo pulsante. La membrana puede colonizarse también, además, con células endoteliales.

El documento DE 10 2004 037 184 B3 revela un procedimiento para fabricar un constructo de implante tisular que comprende (a) la aplicación de células específicas del órgano (concretamente... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de fabricación de un constructo de trasplante tisular para reconstruir un órgano humano o animal, en el que el constructo de trasplante tisular consta de una membrana y células células endoteliales microvasculares, comprendiendo los pasos de

(a) aislar células endoteliales microvasculares dermales o células endoteliales de vejiga microvasculares;

(b) aplicar las células endoteliales microvasculares sobre una membrana acelular biológicamente compatible;

(c) cultivar bajo inducción estromal o bajo inducción epitelial-estromal las células endoteliales microvasculares que se han aplicado sobre la membrana acelular biológicamente compatible, para formar en la membrana estructuras microvasculares consistentes en células endoteliales microvasculares.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el órgano humano o animal se selecciona del grupo que comprende la vejiga de la orina, el uréter y la uretra.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, caracterizado porque las células endoteliales microvasculares son células endoteliales microvasculares específicas del órgano.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las células endoteliales microvasculares son células endoteliales microvasculares autólogas.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la inducción estromal se realiza empleando células estromales de vejiga humanas o animales o células progenitoras estromales de médula ósea humanas o animales.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque, una vez concluido el cultivo de las células endoteliales microvasculares que se han aplicado sobre la membrana acelular biológicamente compatible, se aplican sobre la membrana y se cultivan allí, bajo inducción estromal o bajo inducción urotelial-estromal (paso (c)), otras células específicas del tejido.

7. Constructo de trasplante tisular para reconstruir un órgano humano o animal, que consta de

(a) una membrana acelular biológicamente compatible; y

(b) células endoteliales microvasculares que atraviesan la membrana, siendo las células endoteliales microvasculares células endoteliales microvasculares dermales o células endoteliales de vejiga microvasculares;

en donde están formadas dentro de la membrana unas estructuras microvasculares a base de las células endoteliales microvasculares.

8. Constructo de trasplante tisular según la reivindicación 7, caracterizado porque el órgano humano o animal se selecciona del grupo que comprende la vejiga de la orina, el uréter y la uretra.

9. Constructo de trasplante tisular según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, caracterizado porque las células endoteliales microvasculares son células endoteliales microvasculares específicas del órgano.

10. Constructo de trasplante tisular según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque las células endoteliales microvasculares son células endoteliales microvasculares autólogas.

11. Constructo de trasplante tisular según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, caracterizado porque las estructuras microvascularse comprenden lúmenes.

12. Constructo de trasplante tisular según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 11, caracterizado porque las estructuras microvasculares están reticuladas.

13. Constructo de trasplante tisular según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12, caracterizado porque las estructuras microvasculares se han formado in vitro.