Un método de producción de ácido L-glutámico, que comprende la etapa de cultivar una bacteria corineforme que expresa una enzima codificada por un gen que biosintetiza ácido L-glutámico,

seleccionada entre el grupo que consiste en glutamato deshidrogenasa (GDH), citrato sintasa (CS), isocitrato deshidrogenasa (ICDH), piruvato deshidrogenasa (PDH) y aconitasa (ACO), y en el que una secuencia del promotor de dicho gen que biosintetiza ácido L-glutámico, situada sobre un cromosoma de la bacteria, contiene por lo menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en

i) una secuencia TTGTCA, TTGACA o TTGCCA en la región -35 de la secuencia del promotor; ii) la secuencia TATAAT en la región -10 de la secuencia del promotor; y iii) una combinación de (i) y (ii)

Bacterias corineformes para producir L-GLU.

Fundamento de la invención

La presente invención se refiere a un método de construcción de una cepa mutante capaz de producir ácido L-glutámico con alto rendimiento, y a un método de producción de ácido L-glutámico por fermentación con el mu- tante.

Los métodos de construcción de cepas mutantes que pueden emplearse para producir aminoácidos por fermentación, pueden clasificarse ampliamente en dos métodos. Uno de ellos comprende introducir en un DNA mutaciones aleatorias con un mutágeno químico, y la otra comprende la recombinación genética. En este último método, puede desarrollarse una cepa que tiene capacidad mejorada de producción de la sustancia deseada, mediante intensificación de un gen sobre un camino metabólico relacionado con la biosíntesis de la sustancia pretendida, o por debilitación de un gen de una enzima relacionada con la destrucción. A este respecto, para intensificar un gen pretendido, ha sido utilizado, principalmente, un plásmido capaz de replicarse de modo autónomo, independientemente del cromosoma de una célula.

Sin embargo, el método de intensificación con un plásmido del gen pretendido presenta problemas. En particular, el grado de enriquecimiento del gen pretendido es variable, dependiendo del número de copias del propio plásmido. Por consiguiente, para algunos tipos de genes pretendidos, las copias son con frecuencia demasiadas y,como resultado de ello, la expresión se hace excesiva, el crecimiento resulta seriamente inhibido o la capacidad de producción de la sustancia pretendida disminuye. En tales casos, aun cuando el grado de intensificación del gen pretendido puede hacerse disminuir usando un plásmido de un número de copias pequeño, la variedad del plásmido está limitada en muchos casos, y es imposible la regulación que se pretende obtener del nivel de expresión del gen.

Otro problema es que, dado que la replicación del plásmido es con frecuencia inestable, el plásmido resulta eliminado.

Por ejemplo, la Solicitud de Patente Japonesa Publicada, sin examinar, (a la que se hace referencia en esta memoria más adelante como J.P. KOKAI) No. 61-268185, describe un DNA recombinante que comprende un fragmento de DNA que contiene un gen que produce glutamato deshidrogenasa (GDH) (gen de glutamato deshidrogenasa) que deriva de una bacteria corineforme que produce glutamato, y un fragmento de DNA (plásmido) que contiene un gen necesario para la replicación autónoma en la célula. Asimismo está descrito en ella que por introducción del DNA recombinante en una célula, puede cultivarse una cepa enriquecida en GDH para mejorar la producción de sustancias (tales como aminoácidos y proteínas) con microorganismos.

Por otra parte, en la Patente Japonesa No. 2.520.895, el DNA recombinante antes descrito es introducido en una bacteria corineforme obteniendo una cepa que posee actividad enzimática mejorada, y se produce ácido L-glutámico por fermentación con la cepa. No obstante, la producción y el rendimiento de ácido L-glutámico eran insatisfactorios todavía. Por tanto, se ha pedido mejorar adicionalmente la productividad de ácido L-glutámico. Se ha indicado que la petición ha sido alcanzada mediante la introducción en una bacteria corineforme, de un DNA recombinante que comprende dos tipos de genes., a saber, un gen que produce glutamato deshidrogenasa derivado desde una bacteria corineforme que produce glutamato, y un gen de isocitrato deshidrogenasa (ICDH).

Además, la J.P KOKAI No. 6-502548 describe un sistema de expresión y un sistema de secreción de Corynebacterium que comprende una cepa de una bacteria corineforme y una casete secretora que comprende la primera secuencia de DNA funcional para la expresión en la cepa, codificando la segunda secuencia de DNA aminoácidos polipéptidos y/o proteínas, estando insertada la tercera secuencia de DNA entre la primera secuencia de DNA y la segunda secuencia de DNA, en el que la tercera secuencia de DNA codifica el elemento proteínico seleccionado entre PS1 y PS2, lo que garantiza la secreción de los aminoácidos, polipéptidos y/o proteínas. Específicamente, la secreción de polipéptidos está descrita en ella y, en particular, se llevó a cabo mutagénesis de NTG con una bacteria corineforme y un mutante resistente al 4-fluoroglutamato (4FG) que es un análogo al glutamato, que es seleccionado y sometido a la transformación con PCGL141. Se describe en ella que puede obtenerse una cepa que posee una expresión intensificada de GDH de la bacterias resistentes al análogo. También se describe en ella que se observó una mutación en la secuencia de los nucleótidos No. 251 a No. 266 del promotor de GDH.

Patek et al., 1996, describen la clonación y mapeo de los promotores de cinco genes de C-glutamicum aislados previamente. Un análisis comparativo reveló secuencias conservadas aproximadamente 35 bp y 10 bp aguas arriba del sitio de comienzo de la transcripción.

Descripción de la invención

El objeto de la presente invención es proporcionar un método de construcción de un mutante capaz de intensificar o regular adecuadamente la expresión de un gen deseado sin usar un plásmido, y capaz, asimismo, de producir ácido L-glutámico con alto rendimiento, por recombinación o mutación génica.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un promotor para la GDH capaz de comunicar capacidad de producción de ácido glutámico con alto rendimiento a una cepa de una bacteria corineforme sin aumentar grandemente la cantidad de ácido aspártico y de alanina que se obtienen como subproductos.

Todavía otro objeto de la presente invención es proporcionar un gen de GDH que tiene la secuencia del promotor para GDH anteriormente descrito.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una cepa de una bacteria corineforme que posee el gen antes descrito y que es capaz de producir ácido L-glutámico.

Otro objeto de la presente invención en proporcionar un método de producción de aminoácidos por fermentación en el que se usa el microorganismo que produce aminoácidos construido de ese modo.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un método de fermentación para producir ácido L-glutámico a bajo costo, aumentando el rendimiento de ácido L-glutámico mediante el uso de una bacteria corineforme que produce ácido L-glutámico.

La presente invención ha sido completada sobre la base del descubrimiento de que los problemas anteriormente descritos pueden ser resueltos eficazmente modificando de diversos modos el promotor de genes de realización de la biosíntesis del ácido L-glutámico, situados en un cromosoma, para regular la cantidad de la expresión de los genes deseados. En particular, la invención ha sido completada sobre la base del descubrimiento de que el problema descrito puede ser resuelto eficazmente mediante la introducción de una mutación específica en la región -35 o en la región -10, que son regiones específicas del promotor.

Específicamente, la presente invención se refiere a:

1. Un método de producción de ácido L-glutámico, que comprende la etapa de cultivar una bacteria corineforme que expresa una enzima codificada por un gen que biosintetiza ácido L-glutámico, seleccionada entre el grupo que consiste en glutamato deshidrogenasa (GDH), citrato sintasa (CS), isocitrato deshidrogenasa (ICDH), piruvato deshidrogenasa (PDH) y aconitasa (ACO), y en el que una secuencia del promotor de dicho gen que biosintetiza ácido L-glutámico, situada sobre un cromosoma de la bacteria, contiene por lo menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en

2. El método según la reivindicación 1, en el que el promotor del gen de GDH contiene al menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en:

3. El método según la reivindicación 1, en el que el promotor del gen de CS contiene al menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en:

4. El método según la reivindicación 1, en el que el promotor del gen de ICDH contiene al menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en:

5. El método según la reivindicación 1, en el que el promotor del gen de PDH contiene al menos una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en:

6. Un método de producción de ácido L-glutámico, que comprende la etapa de cultivar una bacteria corineforme que expresa una enzima codificada por el gen de citrato sintasa (CS), en el que una secuencia del promotor del gen de CS colocada sobre un cromosoma de la bacteria, contiene la secuencia ATGGCT en la región -35 de la secuencia del promotor y la secuencia TATAAC en la región -10 de la secuencia del promotor.