ANTICUERPOS INTRACELULARES.

Procedimiento para determinar la capacidad de un dominio único VH de inmunoglobulina de unirse a una diana en un entorno intracelular,

que comprende las etapas de:

a) proporcionar una primera molécula y una segunda molécula, en el que la interacción estable de la primera y segunda moléculas conlleva a la generación de una señal;

b) proporcionar un dominio de inmunoglobulina VH intracelular único que está asociado con la primera molécula, estando dicho dominio VH de inmunoglobulina único libre de dominios de inmunoglobulina complementarios;

c) proporcionar una diana intracelular que está asociada con la segunda molécula, de manera que dicha asociación del dominio VH de inmunoglobulina y la diana conlleva a una interacción estable de la primera y segunda moléculas y a la generación de una señal;

d) evaluar la interacción intracelular entre el dominio de inmunoglobulina y la diana monitorizando la señal;

en el que el dominio VH muestra, como mínimo, un 85% de homología con la secuencia consensuada mostrada en la figura 5a y representada en la SEQ ID No. 3

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/GB2003/004942.

Solicitante: MEDICAL RESEARCH COUNCIL.

Nacionalidad solicitante: Reino Unido.

Dirección: 20 PARK CRESCENT,LONDON W1B 1AL.

Inventor/es: RABBITTS,TERENCE HOWARD, TANAKA,TOMOYUKI.

Fecha de Publicación: .

Fecha Concesión Europea: 6 de Enero de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07K16/32 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02;   proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra productos de traducción de oncogenes.

Clasificación PCT:

  • C07K16/00 C07K […] › Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales.
  • C07K16/32 C07K 16/00 […] › contra productos de traducción de oncogenes.
  • C12N15/13 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Inmunoglobulinas.
  • C12N15/85 C12N 15/00 […] › para células animales.
  • G01N33/53 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.

Clasificación antigua:

  • C07K16/00 C07K […] › Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales.
  • C07K16/32 C07K 16/00 […] › contra productos de traducción de oncogenes.
  • C12N15/13 C12N 15/00 […] › Inmunoglobulinas.
  • C12N15/85 C12N 15/00 […] › para células animales.
  • G01N33/53 G01N 33/00 […] › Ensayos inmunológicos; Ensayos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas; Materiales a este efecto.
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Fragmento de la descripción:

Anticuerpos intracelulares.

La presente invención se refiere a anticuerpos intracelulares de dominio único y librerías de anticuerpos intracelulares de dominio único, así como a procedimientos para preparar y utilizar dichos anticuerpos y librerías de anticuerpos.

Se ha demostrado que los anticuerpos intracelulares o intracuerpos que funcionan en el reconocimiento de antígenos en las células de organismos superiores (revisado en Cattaneo, A. y Biocca, S. (1997) Intracelullar antibodies: Development and Applications ("Anticuerpos intracelulares: Desarrollo y Aplicaciones"). Landes and Springer-Verlang). Esta interacción puede influenciar la función de proteínas celulares que pueden ser inhibidas con éxito en el citoplasma, el núcleo o en las vías de secreción. Esta eficacia se ha demostrado para la resistencia viral en biotecnología de plantas (Tavladoraki, P., y otros (1993) Nature 366: 469-472) y se han reportado varias aplicaciones de anticuerpos intracelulares unidos a proteínas virales del VIH (Mhashilkar, A. M. y otros (1995) EMBO J 14: 1542-51; Duan, L. & Pomerantz, R. J. (1994) Nucleic Acid Res 22: 5433-8; Maciejewski, J. P. y otros. (1995) Nat Med 1: 667-73; Levy-Mintz, P. y otros (1996) J. Virol. 70: 8821-8832) y a productos de oncogenes (Biocca, S., Pierandrei-Amaldi, P. y Cattaneo, A. (1993) Biochem Biophys Res Commun 197: 422-7; Biocca, S., Pierandrei-Amaldi, P., Campioni, N. y Cattaneo, A. (1994) Biotechnology (N Y) 12: 396-9); Cochet, O. y otros (1998) Cancer Res 58: 1170-6). Ésta última es un área importante porque la expresión forzada de oncogenes a menudo ocurre en células tumorales después de translocaciones cromosomales (Rabbitts, T. H. (1994) Nature 372: 143-149). Estas proteínas son, por lo tanto, importantes objetivos terapéuticos intracelulares (Rabbitts, T. H. (1988) New Eng. J. Med 338: 192-194) que pueden ser inactivadas mediante la unión con anticuerpos intracelulares. Finalmente, los esfuerzos internacionales para secuenciar el genoma completo producirán un número masivo de secuencias de genes potenciales que codifican proteínas de las que nada se conoce.

La genómica funcional es un enfoque para determinar la función de esta plétora de proteínas y el uso de anticuerpos intracelulares promete ser una herramienta importante en este esfuerzo como un enfoque conceptualmente simple para bloquear la función de la proteína directamente mediante la unión de un anticuerpo dentro de la célula.

Recientemente, los presentes inventores han descrito una técnica para la selección de inmunoglobulinas que son estables en un entorno intracelular, están correctamente plegadas y son funcionales con respecto a la unión selectiva de su ligando en ese entorno. Lo anterior se describe en la solicitud de Patente internacional WO00/54057. En este enfoque, el procedimiento de interacción antígeno-anticuerpo utiliza antígeno unido a un dominio de unión a ADN como cebo y el scFv unido a un dominio de activación transcripcional como presa. La interacción específica de los dos facilita la activación transcripcional de un gen reportero seleccionable. Se realiza una etapa inicial de unión in vitro, en la que se ensaya un antígeno para unirlo a un repertorio de moléculas de inmunoglobulina. Aquellas inmunoglobulinas que se encuentren unidas a su ligando en ensayos in vitro son ensayadas a continuación para determinar su capacidad de unión a un antígeno seleccionado en un entorno intracelular, generalmente en un entorno citoplasmático.

En la solicitud de Patente internacional WO 2003/014960 relacionada se describen procedimientos para preparar inmunoglobulinas intracelulares basadas en una estructura consensuada, utilizando opcionalmente utilizando la técnica de captura intracelular del documento WO00/54057.

El dominio de unión a antígeno de un anticuerpo comprende dos regiones separadas: un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL: que puede ser Vkappa o Vlambda). El sitio de unión a antígeno por sí mismo está formado por seis lazos de polipéptidos: tres del dominio VH (H1, H2 y H3)y tres de dominio VL (L1, L2 y L3). Se produce un diverso repertorio primario de genes V que codifican los dominios VH y VL mediante reordenamiento combinatorio de segmentos de genes. El gen VH se produce mediante recombinación de tres segmentos de genes, VH, D y JH. En humanos, hay muchos segmentos VH funcionales (Cook y Tomlinson (1995) Immunol Today, 16: 237), 25 segmentos D funcionales (Corbett y otros (1997) J. Mol. Biol., 268: 69) y seis segmentos JH funcionales (Rabetch y otros (1981) Cell, 27:583), dependiendo del haplotipo. El segmento VH codifica la región de la cadena polipeptídica que forma el primer y segundo lazo de unión a antígeno del dominio VH (H1 y H2), mientras que los segmentos VH, D y JH se combinan para formar el tercer lazo de unión a antígeno del dominio VH (H3). El gen VL se produce mediante recombinación de sólo dos segmentos de genes, VL y JL. En humanos, hay aproximadamente 40 segmentos VH funcionales (Schable and Zachau (1993) Biol. Chem. Hopp-Seyer, 374: 1001), 31 segmentos VL funcionales (Williams y otros 1996) J.Mol. Biol., 264: 220; Kawasaki y otros (1997) Genome Res., 7: 250), 5 segmentos Jkappa funcionales (Hieter y otros (1982) J. Biol. Chem., 257: 1516) y 4 segmentos Jlambda funcionales (Vasicek and Leder (1990) J. Exp. Med. 172: 609), dependiendo del haplotipo. El segmento VL codifica la región de la cadena polipeptídica que forma el primer y segundo lazo de unión a antígeno del dominio VL (L1 y L2) mientras que los segmentos VL y JL se combinan para formar el tercer lazo de unión a antígeno del dominio VL (L3). Se cree que anticuerpos seleccionados de este repertorio primario sean suficientemente diversos para unirse a casi todos los antígenos, como mínimo, con afinidad moderada. Los anticuerpos de alta afinidad se producen mediante "maduración por afinidad" de los genes reordenados, en la que se generan mutaciones puntuales y se seleccionan por el sistema inmune sobre la base de unión mejorada.

El análisis de las estructuras y secuencias de anticuerpos ha mostrado que cinco de los seis lazos de unión a antígeno (H1, H2, L1, L2, L3) poseen un número limitado de conformaciones de la cadena principal o estructuras canónicas (Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901; Chothia y otros (1989) Nature, 342: 877). Las conformaciones de la cadena principal se determinan mediante (i) la longitud del lazo de unión a antígeno, y (ii) residuos particulares, o tipos de residuos, en cierta posición clave en el lazo de unión a antígeno y la estructura del anticuerpo. El análisis de las longitudes de los lazos y los residuos clave ha permitido predecir las conformaciones de la cadena principal de H1, H2, L1, L2 y L3 codificados por la mayoría de las secuencias de anticuerpo humano (Chothia y otros (1992) J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinson y otros (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams y otros (1996) J. Mol. Biol., 264: 220). Aunque la región H3 es mucho más diversa en términos de secuencia, longitud y estructura (debido al uso de segmentos D), también forma un número limitado de conformaciones de la cadena principal para longitudes cortas de lazo que dependen de la longitud y de la presencia de residuos particulares, o tipos de residuo, en posiciones clave en el lazo y en la estructura del anticuerpo (Martin y otros (1996) J. Mol. Biol., 263: 800; Shirai y otros (1996) FEBS Letters, 399:1.

Los fragmentos variables de cadena sencilla, también conocidos como, scFv, que están compuestos por dominios variables de cadena pesada (H) y ligera (L) y un péptido enlazador flexible para crear una cadena de polipeptídica única, han sido reconocidos como la forma más adecuada de ICAb porque la asociación normal de las cadenas H y L libres se produce en el retículo endoplasmático y no se produce en el citoplasma de las células. Por otra parte, los scFv son polipéptidos sencillos en los que VH y VL se asocian por afinidad intrínseca y no son necesarios enlaces disulfúricos entre las cadenas. En realidad, este formato se ha demostrado que es efectivo contra proteínas diana in vivo cuando se seleccionan según las técnicas anteriormente descritas por los presentes inventores (véase el documento WO00/54057) pero comparativamente, pocos scFv trabajan tan eficientemente como los ICAb...

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento para determinar la capacidad de un dominio único VH de inmunoglobulina de unirse a una diana en un entorno intracelular, que comprende las etapas de:

a) proporcionar una primera molécula y una segunda molécula, en el que la interacción estable de la primera y segunda moléculas conlleva a la generación de una señal;
b) proporcionar un dominio de inmunoglobulina VH intracelular único que está asociado con la primera molécula, estando dicho dominio VH de inmunoglobulina único libre de dominios de inmunoglobulina complementarios;
c) proporcionar una diana intracelular que está asociada con la segunda molécula, de manera que dicha asociación del dominio VH de inmunoglobulina y la diana conlleva a una interacción estable de la primera y segunda moléculas y a la generación de una señal;
d) evaluar la interacción intracelular entre el dominio de inmunoglobulina y la diana monitorizando la señal;

en el que el dominio VH muestra, como mínimo, un 85% de homología con la secuencia consensuada mostrada en la figura 5a y representada en la SEQ ID No. 3.

2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la primera y/o segunda moléculas son polipéptidos.

3. Procedimiento, según la reivindicación 2, en el que la primera y segunda moléculas se asocian para formar una molécula reportera activa.

4. Procedimiento, según la reivindicación 3, en el que la molécula reportera activa se selecciona del grupo que comprende un factor de transcripción, un enzima y una molécula bioluminiscente.

5. Procedimiento, según la reivindicación 4, en el que la molécula reportera activa es un enzima y el procedimiento se realiza en presencia de un sustrato para el enzima.

6. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones 4 ó 5, en la que la primera y segunda moléculas son dominios de la molécula reportera activa.

7. Procedimiento, según la reivindicación 6, en el que la primera molécula es el dominio de activación de VP16 y la segunda molécula es el dominio de unión a ADN de LexA.

8. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la señal se selecciona del gripo que comprende un cambio de una propiedad óptica y la activación de un gen reportero.

9. Procedimiento, según la reivindicación 8, en el que la señal permite la selección de células.

10. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dominio único de inmunoglobulina es proporcionado expresando un ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina dentro de la célula.

11. Procedimiento, según la reivindicación 10, en el que el ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina se obtiene de una librería de ácidos nucleicos que codifican inmunoglobulinas.

12. Procedimiento, según la reivindicación 11, en el que la librería codifica un repertorio de inmunoglobulinas.

13. Procedimiento, según la reivindicación 11, en el que la librería se construye a partir de ácidos nucleicos aislados de un organismo que ha sido inmunizado con un antígeno.

14. Procedimiento, según la reivindicación 1, que comprende la etapa adicional de:

e) aislar aquellos dominios únicos de inmunoglobulina que den lugar a una señal.

15. Procedimiento, según la reivindicación 14, que comprende la etapa adicional de:

f) someter los dominios únicos de inmunoglobulina seleccionados a ensayos intracelulares funcionales.

16. Procedimiento, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que uno o ambos del dominio único de inmunoglobulina y la diana, junto con la primera o segunda moléculas, son proporcionados en forma de construcciones de ácidos nucleicos que se transcriben para producir dicha inmunoglobulina y/o diana junto con dichas primera o segunda moléculas.

17. Procedimiento para la preparación de un dominio único de inmunoglobulina adecuado para utilizar en un procedimiento según la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

a) expresar un repertorio de genes de dominios de inmunoglobulina en un sistema de selección y aislar aquellos genes que codifican dominios de inmunoglobulina específicos para una diana deseada;
b) poner en asociación operativa los genes aislados con ácidos nucleicos que codifican una primera molécula, en el que la interacción estable de la primera molécula con una segunda molécula genera una señal, para producir un polipéptido de fusión que comprende el dominio de inmunoglobulina y la primera molécula;

en el que cada gen de dominio de inmunoglobulina codifica;

a) un dominio de inmunoglobulina VH intracelular único que muestra, como mínimo, un 85% de homología con respecto a la secuencia consensuada mostrada en la figura 5a y representada como SEQ ID NO.3.

18. Librería de dominios únicos de inmunoglobulinas asociada de manera operativa con un una primera molécula, en la que la interacción estable de la primera molécula y una segunda molécula conlleva a la generación de una señal; en la que cada dominio único de inmunoglobulina comprende

a) un dominio de inmunoglobulina VH intracelular único que muestra, como mínimo, un 85% de homología con respecto a la secuencia consensuada mostrada en la figura 5a y representada como SEQ ID NO.3.

19. Librería, según la reivindicación 18, en la que la primera y/o segunda moléculas son polipéptidos.

20. Librería, según la reivindicación 18 ó 19, en la que la primera y/o segunda moléculas se asocian para formar una molécula reportera activa.

21. Librería, según la reivindicación 20, en la que la molécula reportera activa se selecciona del grupo que comprende un factor de transcripción, un enzima y una molécula bioluminiscente.

22. Librería, según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 21, en la que la primera y segunda moléculas son dominios de la molécula reportera activa.

23. Librería, según la reivindicación 22, en la que la primera molécula es el dominio de activación de VP16 y la segunda molécula es el dominio de unión a ADN de LexA.

24. Procedimiento para preparar una inmunoglobulina de dominio único intracelular que se une a una diana en un entorno intracelular, que comprende las etapas de:

a) proporcionar una primera molécula y una segunda molécula, en el que la interacción estable de la primera y segunda moléculas conlleva a la generación de una señal;
b) proporcionar una inmunoglobulina intracelular que está asociada con la primera molécula;
c) proporcionar una diana intracelular que está asociada con la segunda molécula, de manera que la asociación de la inmunoglobulina y la diana conlleva a una interacción estable de la primera y segunda moléculas y a la generación de la señal;
d) evaluar la interacción intracelular entre la inmunoglobulina y la diana monitorizando la señal; y
e) seleccionar una o más inmunoglobulinas que interactúan con la diana y aislar una o más inmunoglobulinas de dominio único de las mismas;

en el que el cada inmunoglobulina de dominio único comprende

a) un dominio de inmunoglobulina VH intracelular único que muestra, como mínimo, un 85% de homología con la secuencia consensuada mostrada en la figura 5a y representada en la SEQ ID No. 3.

25. Procedimiento, según la reivindicación 24, que comprende además la etapa de mutar las regiones marco de las inmunoglobulinas de dominio único para mejorar la unión intracelular y/o estabilidad.


 

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