OLIGONUCLEÓTIDOS MONOCATENARIOS COMPLEMENTARIOS DE ELEMENTOS REPETITIVOS PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS GENÉTICOS ASOCIADOS A LA INESTABILIDAD DE REPETICIONES DE ADN.

Uso de un oligonucleótido que consiste en una única cadena, con una longitud de 10 a 50 nucleótidos,

que consiste en 2'-O-metil fosforotioato nucleótidos de ARN y que consiste en una secuencia que es complementaria sólo a un elemento repetitivo en un transcrito de gen tal y como se determina más abajo, para la producción de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno genético asociado a una inestabilidad de repetición de elementos cis en humanos tal y como se determina más abajo, caracterizado por el hecho de que dicho elemento repetitivo en un transcrito de gen se selecciona en el grupo que consiste en (CAG)n y (CUG)n: - el oligonucleótido consiste en una secuencia que es complementaria a un tracto de poliglutamina (CAG)n, donde el trastorno de inestabilidad de repetición es enfermedad de Huntington, ataxias espino-cerebelosas, síndrome de Haw River, atrofia muscular espinobulbar ligada al cromosoma X y/o atrofia dentatorubro-palidoluysiana, - el oligonucleótido consiste en una secuencia que es complementaria a una repetición (CUG)n, en el que el trastorno de inestabilidad de repetición es distrofia miotónica de tipo 1, ataxia espino-cerebelar 8 y/o enfermedad del Huntington de tipo 2

Oligonucleótidos monocatenarios complementarios de elementos repetitivos para el tratamiento de trastornos genéticos asociados a la inestabilidad de repeticiones de ADN

La presente invención se refiere al campo de la medicina, en particular al tratamiento de trastornos genéticos asociados a genes que tienen repeticiones inestables en sus secuencias codificantes o no codificantes, más en particular, repeticiones inestables en la enfermedad humana de Huntington causada por el gen HD, o distrofia miotónica tipo 1 causada por el gen DMPK.

Inestabilidad de microsatélite específico de gen y secuencias repetitivas de minisatélite, que conducen a un aumento en la longitud de las secuencias repetitivas en el satélite, se asocian a alrededor de 35 trastornos genéticos humanos. La inestabilidad de repeticiones de trinucleótido se encuentra, por ejemplo, en genes causantes de atrofia muscular espinobulbar ligada al cromosoma X, distrofia miotónica tipo 1 (DM1) , síndrome X frágil (genes FRAX A, E, F) , enfermedad de Huntington (HD) y diferentes ataxias espinocerebelares (familia del gen SCA) . Las repeticiones inestables se encuentran en las regiones de codificación de los genes, como el gen de la enfermedad de Huntington, en la que el fenotipo del trastorno es causado por la alteración de la función de las proteínas y/o por el plegamiento de las proteínas. Las unidades de repetición inestables también se encuentran en regiones no traducidas, como en la distrofia miotónica tipo 1 (DM1) en el 3' UTR, o en secuencias intrónicas, como en la distrofia miotónica tipo 2 (DM2) .

El número normal de repeticiones es alrededor de 5 a 37 para DMPK, pero aumenta para premutación y estado completo de la enfermedad de dos a diez pliegues o más, para 50, 100 y a veces 1000 o más unidades de repetición.

Para DM2/ZNF9 se ha informado que aumenta a 10, 000 o más repeticiones (Clear y y Pearson, Cytogenet. Genome Res. 100: 25-55, 2003) .

El gen causativo de la enfermedad de Huntington, HD, se localiza en el cromosoma 4. La enfermedad de Huntington se hereda de manera autosómica dominante. Cuando el gen tiene más de 35 repeticiones de trinucleótido CAG que codifican una extensión de poliglutamina, el número de repeticiones puede ampliarse en generaciones sucesivas. Debido al aumento progresivo en la longitud de las repeticiones, la gravedad de la enfermedad tiende a aumentar y se presenta a una edad anterior en generaciones sucesivas, un proceso llamado anticipación. El producto del gen HD es la proteína citoplasmática huntingtina 348 kDa. La huntingtina tiene una secuencia característica menor de 40 residuos de aminoácidos de glutamina en la forma normal; la huntingtina mutada que causa la enfermedad tiene más de 40 residuos. La expresión continua de moléculas de huntingtina mutantes en células neuronales produce la formación de depósitos de proteína grandes que finalmente dan lugar a muerte celular, especialmente en los lóbulos frontales y los ganglios basales (principalmente en el núcleo caudado) . La gravedad de la enfermedad es generalmente proporcional al número de residuos extra.

DM1 es la distrofia muscular más común en adultos y es un trastorno progresivo degenerativo multisistémico heredado de predominantemente el músculo esquelético, corazón y cerebro. DM1 es provocada por expansión de una repetición inestable del trinucleótido (CTG) n en la región 3' no traducida del gen DMPK (proteína quinasa de distrofia miotónica) en el cromosoma humano 19q (Brook et al, Cell, 1992) . La distrofia miotónica de tipo 2 (DM2) es provocada por una expansión CCTG en el intrón 1 del gen ZNF9, (Liquori et al, Science 2001) . En el caso de la distrofia miotónica tipo 1, la exportación citoplásmica nuclear de transcritos DMPK se bloquea por la longitud aumentada de las repeticiones, que forman estructuras secundarias tipo horquilla que se acumulan en focos nucleares. Transcritos DMPK que soportan un largo tracto (CUG) n pueden formar estructuras tipo horquilla que enlazan proteínas de la familia muscleblind y posteriormente se agregan en focos ribonucleares en el núcleo. Estas inclusiones nucleares están pensadas para aislar proteínas muscleblind, y potencialmente otros factores, que luego se convierten en limitantes para la célula. En DM2, la acumulación de ARN ZNF9 que lleva las repeticiones expandidas (CCUG) n forma focos similares.

Ya que las proteínas muscleblind son factores de empalme, su depleción da lugar a un reordenamiento espectacular en el empalme de otros transcritos. En consecuencia, los transcritos de muchos genes se convierten aberrantemente en empalmados, por ejemplo, por inclusión de exones fetales, o exclusión de exones, dando como resultado proteínas no funcionales y función de célula perjudicada.

Las observaciones y revelaciones nuevas de arriba han conducido a la comprensión de que enfermedades de repetición inestable, como distrofia miotónica tipo 1, la enfermedad de Huntington y otras, pueden ser tratadas eliminando, o completamente o al menos en parte, el transcrito aberrante que causa la enfermedad. Para DM1, el transcrito aberrante que se acumula en el núcleo podría reducirse o quitarse completamente. Reducciones incluso relativamente pequeñas del transcrito aberrante podrían liberar sustancial y posiblemente cantidades suficientes de factores celulares aislados y así ayudar a devolver el procesamiento normal del ARN y el metabolismo celular para DM (Kanadia et al., PNAS 2006) . En el caso de HD, una reducción en la acumulación de depósitos de proteína de huntingtina en las células de un paciente HD puede mejorar los síntomas de la enfermedad.

Unos pocos intentos se han llevado a cabo para diseñar métodos de tratamiento y medicamentos para repeticiones inestables de la distrofia miotónica tipo 1 usando ácidos nucleicos antisentido, ARN de interferencia o ribozimas.

(i) Langlois et al. (Molecular Therapy, Vol. 7 No. 5, 2003) diseñó una ribozima capaz de romper el ARNm DMPK. La ribozima de cabeza de martillo dispone de una extensión ARN complementaria al 3' UTR de DMPK justo antes de la repetición CUG. In vivo, la ribozima transcrita de vector fue capaz de romper y disminuir en células modificadas tanto en las repeticiones expandidas CUG con ARNm como en las especies de ARNm normales con un 63 y 50 % respectivamente. Por lo tanto, también el transcrito normal es afectado gravemente por este método y las especies de ARNm afectadas con repeticiones expandidas no son específicamente dirigidas.

(ii) Otro método fue tomado por Langlois et al., (Journal Biological Chemistr y , vol 280; not.17, 2005) usando ARN de interferencia. Una horquilla corta entregada de lentivirus ARN (ARNhc) fue introducida en mioblastos DM1 y demostraron reducir el ARNm DMPK nuclear mutante retenido. Cuatro moléculas de ARNhc fueron evaluadas, dos fueron complementarias contra las regiones codificadas por DMPK, una contra una única secuencia en el 3' UTR y un control negativo con una secuencia irrelevante. Los primeros dos ARNhc fueron capaces de reducir el transcrito mutante de DMPK con la repetición amplificada a alrededor de 50%, pero incluso más eficaz, la reducción del transcrito citoplasmático de tipo salvaje a alrededor de 30% o menos. El equivalente sintético de ARNsi entregado por lípidos catiónicos fue inefectivo. El ARNhc dirigido a la secuencia 3' UTR probó ser inefectivo para ambos transcritos. Por lo tanto, tampoco este método está dirigido selectivamente a especies de ARNm de repetición expandidas.

(iii) Un tercer método por Furling et al. (Gene Therapy, Vol.10, p795-802, 2003) usa un retrovirus recombinante que expresa una larga cadena de 149 pares de bases ARN antisentido para inhibir niveles de ARNm DMPK en mioblastos DM1 humanos. Un retrovirus fue diseñado para proporcionar células DM1 con la larga cadena de 149 pares de bases de ARN antisentido complementario a una cadena de pares de bases de 39 de largo de repetición (CUG) 13 y una región de 100 pares de bases después de la repetición para aumentar la especificidad. Este método libró una reducción en el transcrito DMPK mutado (repetición expandida) del 80%, en comparación con una reducción de un 50% en el transcrito DMPK de tipo salvaje y la restauración de diferenciación y características funcionales en mioblastos DM1 infectados. Por lo tanto, tampoco este método está dirigido selectivamente a las especies de ARNm de repetición expandidas, depende de un ARN antisentido muy largo y sólo puede usarse en combinación con técnicas de entrega vírica recombinantes.

Liew et al (Proceedings of the Japan, Academy series B... [Seguir leyendo]

1. Uso de un oligonucleótido que consiste en una única cadena, con una longitud de 10 a 50 nucleótidos, que consiste e.

2. O-metil fosforotioato nucleótidos de ARN y que consiste en una secuencia que es complementaria sólo a un elemento repetitivo en un transcrito de gen tal y como se determina más abajo, para la producción de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un trastorno genético asociado a una inestabilidad de repetición de elementos cis en humanos tal y como se determina más abajo, caracterizado por el hecho de que dicho elemento repetitivo en un transcrito de gen se selecciona en el grupo que consiste en (CAG) n y (CUG) n:

- el oligonucleótido consiste en una secuencia que es complementaria a un tracto de poliglutamina (CAG) n, donde el

trastorno de inestabilidad de repetición es enfermedad de Huntington, ataxias espino-cerebelosas, síndrome de Haw 10 River, atrofia muscular espinobulbar ligada al cromosoma X y/o atrofia dentatorubro-palidoluysiana,

- el oligonucleótido consiste en una secuencia que es complementaria a una repetición (CUG) n, en el que el trastorno de inestabilidad de repetición es distrofia miotónica de tipo 1, ataxia espino-cerebelar 8 y/o enfermedad del Huntington de tipo 2.

2. Uso según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que el oligonucleótido consiste en (CAG) 7 o (CUG) 7.

3. Oligonucleótido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 para el uso en el tratamiento o la prevención de un trastorno genético asociado a inestabilidad de repetición de elementos cis en humanos tal como determinado en la reivindicación 1.

4. Método in vitro para la reducción de repetición con transcritos de gen en una célula comprendiendo la administración de un oligonucleótido tal como definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.