MÉTODO PARA PRODUCIR UN DERIVADO HETERODIMERICO DE LA ENZIMA PROTEINA FOSFATASA DE TIPO 2A.

Un método para producir un derivado heterodimérico de proteína fosfatasa 2A (PP2A),

que comprende las etapas de: infectar células de insecto cultivadas con un baculovirus en el que se integra un ADNc que codifica la subunidad catalítica de PP2A que porta un primer marcador junto con otro baculovirus en el que se integra un ADNc que codifica la subunidad A de PP2A que porta un segundo marcador; incubar las células infectadas; desestabilizar las células incubadas para obtener una suspensión de células desestabilizadas y después purificar la suspensión de células desestabilizadas con un fase sólida que porta una sustancia que puede unirse al primer marcador y otra fase sólida que porta una sustancia que puede unirse al segundo marcador, en el que las células de insecto infectadas con el baculovirus se incuban a una temperatura de 16 a 22ºC

Campo Técnico 5

La presente invención se refiere a un método para producir derivados heterodiméricos de la proteína fosfatasa 2A (en lo sucesivo en este documento con la abreviatura “PP2A”). Más particularmente, se refiere a un método para producir una gran cantidad de derivados heterodiméricos de PP2A que consisten en la subunidad catalítica y la subunidad A de P-P2A, cada una de ellas portando una identificador, de cuyos derivados puede prepararse una PP2A muy pura. 10

Antecedentes de la Técnica

La PP2A es una de las enzimas más básicas entre las hidrolasas por las cuales se hidrolizan los subgrupos fosfato unidos a restos de serina/treonina en una proteína y está formada como un complejo de trímero en el que una subunidad catalítica denominada PP2Ac está unida a una subunidad A y a una subunidad B. Entre estas subunidades, la subunidad catalítica y la subunidad A incluyen dos formas de isoforma  e isoforma . 15

La PP2A que desempeña un papel importante en la transducción de señal in vivo tiene gran demanda como un reactivo bioquímico y se ha incorporado en el mercado a un coste elevado. Además, en los últimos años, existe una necesidad de un reactivo constitutivo para un kit conveniente para la medición de componentes tóxicos, ácidos okadaicos, acumulados en los bivalvos marinos o toxinas de algas verde-azules (microcistinas, nodularinas), sometidos a regulación como ingredientes venenosos en lagos y pantanos. 20

Actualmente, como para la PP2A usada para los objetos mencionados anteriormente, solo se ha conocido un heterodímero de la subunidad A y la subunidad catalítica, denominada PP2A y se preparado a partir de los corpúsculos sanguíneos humanos.

Sin embargo, la PP2A purificada a partir de los corpúsculos sanguíneos humanos es muy costosa debido al proceso de purificación complicado y la dificultad de la purificación a gran escala puesto que se separa de tejidos 25 animales. Además, existía un problema en el uso de la PP2A resultante como un reactivo bioquímico, puesto que de por sí no es probable que sea de suficiente pureza. Además, había otro problema ya que una gran cantidad de PP2A pura no podía producirse a bajo coste o con facilidad para la investigación básica, lo que hizo difícil conseguir la investigación necesaria para el esclarecimiento de una diversidad de procesos vitales que implican la PP2A.

Los presentes inventores estudiaron previamente un método para producir PP2A y descubrieron que en la 30 producción de la deseada subunidad catalítica y la subunidad A de PP2A por un procedimiento de ingeniería genética usando un baculovirus, la unión de un identificador a las subunidades respectivas permitía la fácil separación de otras proteínas para obtener las subunidades en un estado muy puro. Los inventores descubrieron adicionalmente que la producción de la subunidad catalítica y la subunidad A de PP2A que portaban respectivamente identificadores distintos en las mismas células cultivadas obtuvieron un heterodímero de PP2A que consistía en la subunidad catalítica y la 35 subunidad A respectivamente portando diferentes identificadores y que el uso de estos dos identificadores que tenían estas subunidades permitió la fácil purificación sólo del heterodímero deseado [Ikehara T. et al., Protein Expression and Purification 45(2006) 150-156, 1 de julio de 2005]. Basándose en estos hallazgos, se presento la solicitud de patente WO 2006/048923.

Sin embargo, cuando se uso un sistema de expresión baculoviral, hubo otro problema ya que la tasa de PP2A 40 expresada como una proteína insoluble era superior a la de una proteína soluble, disminuyendo de esta manera la tasa de PP2A a purificar, aunque la tasa de expresión era alta.

Descripción de la Invención

Problema que soluciona la Invención

Por tanto, un objeto de la presente invención es proporcionar un medio para solucionar el problema de que la 45 tasa de PP2A a purificar sea baja cuando se usa un baculovirus como un sistema de expresión.

Medios para Solucionar los Problemas

Para solucionar los problemas anteriores, los presentes inventores han estudiado asiduamente las condiciones de cultivo de células de insectos particularmente después de infección con baculovirus y descubrieron que la PP2A soluble a purificar aumentó notablemente en cantidades cuando las células de insecto se incubaron a una temperatura 50 más baja que la empleada en una condición de cultivo habitual. Por tanto, se consigue la invención.

La invención proporciona un método para producir un derivado heterodimérico de la proteína fosfatasa 2A (PP2A) que comprende las etapas de infectar, con un baculovirus, células de insecto cultivadas, en el que se integra un ADNc que codifica la subunidad catalítica de PP2A que porta un primer identificador junto con otro baculovirus en el que

se integra un ADNc que codifica la subunidad A de PP2A que porta un segundo identificador, incubando las células infectadas, después desestabilizando las células incubadas para obtener una suspensión de células desestabilizadas y después purificando la suspensión de células desestabilizadas con una fase sólida que porta la sustancia que puede unirse al primer identificador y otra fase sólida que porta una sustancia que puede unirse al segundo identificador, caracterizado por que las células de insecto infectadas con el baculovirus se incuban a una temperatura de 16 a 22ºC. 5

La invención también proporciona un método para producir un derivado de la subunidad catalítica de PP2A que comprende las etapas de infectar con un baculovirus, células de insecto cultivadas, en el que se integra un ADNc que codifica la subunidad catalítica de PP2A que porta un identificador, incubar las células infectadas, desestabilizar las células incubadas para obtener una suspensión de células desestabilizadas y después purificar la suspensión de células desestabilizadas con una fase sólida que porta una sustancia que puede unirse al identificador, caracterizado por que 10 las células de insecto infectadas con el baculovirus se incuban a una temperatura de 16 a 22ºC.

Además, la invención proporciona un método para producir un derivado de la subunidad A de PP2A que comprende las etapas de infectar células cultivadas de insecto con un baculovirus en el que se integra un ADNc que codifica la subunidad A de PP2A que porta un marcador, incubar las células infectadas, romper las células incubadas para obtener una suspensión de células rotas y después purificar la suspensión de células rotas con una fase sólida 15 que porta una sustancia capaz de unirse al marcador, caracterizado por que las células de insecto infectadas con el baculovirus se incuban a una temperatura de 16 a 22ºC.

Efecto de la Invención

De acuerdo con la invención, los derivados de heterodímero de PP2A que tienen la actividad de PP2A se pueden producir convenientemente en grandes cantidades con alta pureza y no a través de etapas de extracción y 20 purificación complicadas de las técnicas convencionales.

Por lo tanto, los derivados de heterodímero de PP2A obtenidos en la invención se pueden utilizar ampliamente como PP2A cuya demanda como reactivo bioquímico se espera que aumente. Además, se espera que se utilice en el desarrollo de un kit conveniente para la medida de ácidos okadaicos y similares.

Mejor Modo de Realizar la Invención 25

Los términos “derivado” o “derivados” como se usa en el presente documento significan que un marcador se une principalmente a un compuesto original. Por ejemplo, una subunidad catalítica de PP2A que porta un marcador de polihistidina, marcador FLAG, marcador GST, marcador HA o similares se define como un derivado de la subunidad catalítica de PP2A.

En la realización de la invención, primero es necesario obtener una subunidad catalítica marcada de PP2A y un 30 ADNc que codifica una subunidad A de PP2A. El origen preferido del ADNc incluye, pero no está particularmente limitado a, animales tales como ser humano, ratón, rata y similares y se prefiere particularmente ADNc de origen humano.

En el ADNc se puede obtener una subunidad catalítica marcada de PP2A, por ejemplo, preparando un clon plasmídico que contiene un ADNc que codifica las isoformas  o  de la subunidad catalítica de PP2A (PP2Ac) y un 35 cebador correspondiente al marcador...

1. Un método para producir un derivado heterodimérico de proteína fosfatasa 2A (PP2A), que comprende las etapas de:

infectar células de insecto cultivadas con un baculovirus en el que se integra un ADNc que codifica la subunidad catalítica de PP2A que porta un primer marcador junto con otro baculovirus en el que se integra un ADNc que 5 codifica la subunidad A de PP2A que porta un segundo marcador;

incubar las células infectadas;

desestabilizar las células incubadas para obtener una suspensión de células desestabilizadas y después

purificar la suspensión de células desestabilizadas con un fase sólida que porta una sustancia que puede unirse al primer marcador y otra fase sólida que porta una sustancia que puede unirse al segundo marcador, 10

en el que las células de insecto infectadas con el baculovirus se incuban a una temperatura de 16 a 22ºC.

2. Un método para producir un derivado heterodimérico de PP2A de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la subunidad catalítica de PP2A es una subunidad catalítica - o una subunidad catalítica -.

3. Un método para producir un derivado heterodimérico de PP2A de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el primer marcador es un marcador de polihistidina y el segundo marcador es un marcador FLAG. 15

4. Un método para producir un derivado heterodimérico de PP2A de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la sustancia que puede unirse al primer marcador es Ni y la sustancia que puede unirse al segundo marcador es un anticuerpo monoclonal anti-FLAG M2.

5. Un método para producir un derivado de la subunidad catalítica de PP2A, que comprende las etapas de:

infectar células de insecto cultivadas con un baculovirus en el que se integra un ADNc que codifica la subunidad 20 catalítica de PP2A que porta un marcador;

incubar las células infectadas;

desestabilizar las células incubadas para obtener una suspensión de células desestabilizadas y después

purificar la suspensión de células desestabilizadas con un fase sólida que porta una sustancia que puede unirse al marcador, 25

en el que las células de insecto infectadas con el baculovirus se incuban a una temperatura de 16 a 22ºC.

6. Un método para producir un derivado de la subunidad catalítica de PP2A de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la subunidad catalítica de PP2A es una subunidad catalítica - o una subunidad catalítica -.

7. Un método para producir un derivado de la subunidad catalítica de PP2A de acuerdo con la reivindicación 5 ó 6, en el que el marcador es un marcador de polihistidina. 30

8. Un método para producir un derivado de la subunidad catalítica de PP2A de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que la sustancia que puede unirse al marcador es Ni.