Procedimiento para la identificación de al menos dos grupos de microorganismos.

Procedimiento para la identificación de al menos dos grupos de microorganismos que expresan una mismaactividad enzimática,

que comprende las etapas siguientes:

a) la incubación de dichos grupos de microorganismos en un medio de reacción que comprende un primersustrato enzimático y un segundo sustrato enzimático, cuyos primer y segundo sustratos enzimáticos estánmetabolizados por una misma actividad enzimática.

b) la identificación de dichos grupos de microorganismos.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/FR2007/050844.

Solicitante: BIOMERIEUX.

Nacionalidad solicitante: Francia.

Dirección: CHEMIN DE L'ORME 69280 MARCY L'ETOILE FRANCIA.

Inventor/es: ROGER-DALBERT, CELINE, ORENGA, SYLVAIN, JAMES, ARTHUR, PERRY,JOHN.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N1/20 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › Bacterias; Sus medios de cultivo.
  • C12Q1/04 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › Determinación de la presencia o del tipo de microorganismo; Empleo de medios selectivos para la investigación o análisis de antibióticos o bactericidas; Composiciones para este fin que contienen un indicador químico.
  • C12Q1/37 C12Q 1/00 […] › peptidasa o proteinasa.
  • C12Q1/42 C12Q 1/00 […] › fosfatasa.
  • C12Q1/44 C12Q 1/00 […] › esterasa.

PDF original: ES-2448578_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Procedimiento para la identificación de al menos dos grupos de microorganismos La invención se refiere a un procedimiento para la identificación de, al menos, dos grupos de microorganismos que expresan una misma actividad enzimática. La invención se refiere, igualmente, a un medio de reacción particular así 5 como a su utilización para la identificación de, al menos, dos grupos de microorganismos que expresan una misma actividad enzimática.

Desde hace muchos años, se utilizan sustratos enzimáticos particulares para permitir la determinación de la presencia o ausencia de actividades enzimáticas características de microorganismos. Estos sustratos enzimáticos están compuestos, generalmente, de dos partes, una primera parte específica de la actividad enzimática a revelar, 10 llamada igualmente parte diana, y una segunda parte que desempeña el oficio de marcador, llamada parte marcadora, que induce, por ejemplo, una coloración particular de la colonia en el momento de la hidrólisis del sustrato, o la aparición de un precipitado detectable con facilidad. Para la elección de estos sustratos, según que haya reacción o no, por ejemplo una coloración diferente, es posible caracterizar la naturaleza de un microorganismo, o discriminar grupos diferentes de microorganismos. Así pues, en el caso de bacterias, las cepas 15 de Escherichia coli son puestas de manifiesto, frecuentemente, por la revelación de una actividad enzimática de tipo osidasa tal como la actividad !.glucuronidasa o !-galactosidasa. Del mismo modo, el género Listeria puede ser detectado por la puesta de manifiesto de una actividad !-glucosidasa. Se puede citar, igualmente, la detección de una actividad esterasa para, especialmente, la puesta de manifiesto del género Salmonella. En efecto, el género Salmonella posee esterasas inespecíficas capaces de hidrolizar sustratos sintéticos cromógenos, por ejemplo indigogénicos. En el caso de la detección de salmonelas, y más generalmente, en el caso de bacterias con actividad esterasa, la detección y/o la identificación de estas bacterias se lleva a cabo, clásicamente, en medios gelosados que permiten la detección y/o la identificación de colonias sospechosas de bacterias con actividad esterasa.

Sin embargo, una actividad enzimática única no es siempre suficiente para caracterizar un grupo particular de microorganismos de otro grupo de microorganismos. Por ejemplo, si se quiere diferenciar bacterias Gram positivas y 25 bacterias Gram negativas, como por ejemplo las bacterias del grupo KES (Klebsiella, Enterobacter y Serratia, bacterias Gram negativas) , y las del género Enterococcus (bacterias Gram positivas) , es necesario detectar varias actividades enzimáticas para acrecentar la especificidad. Conviene, por tanto, combinar varios sustratos enzimáticos en un mismo medio de cultivo, lo que puede ocasionar un elevado coste de fabricación. Además, en ciertos casos, no es posible poner de manifiesto espontáneamente en un mismo medio de reacción, actividades diferentes dado 30 que las condiciones de expresión de las diferentes actividades no son compatibles. Por consiguiente, en el momento de la utilización del medio cromógeno CPS ID 3 comercializado por bioMérieux, tanto las bacterias del grupo KES (Klebsiella, Enterobacter y Serratia, bacterias Gram negativas) , como las del género Enterococcus (bacterias Gram positivas) , detectadas por una actividad osidasa (beta-glucosidasa) producen colonias de color azulverdoso; la distinción entre los dos grupos debe ser confirmada mediante una etapa suplementaria, por un examen microscópico.

El documento US 4 874 695 divulga un método para la identificación de microorganismos de tipo hongos y levaduras. Dicho método comprende las etapas siguientes: cultivo de los hongos o levaduras que se desconocen; preparación de un inóculo de dichos microorganismos desconocidos; mezcla, separadamente, del inóculo con uno o varios sustratos enzimáticos cromógenos.

El documento EP 0 451 775 divulga un método rápido y preciso de identificación de un microorganismo. Dicho método comprende las etapas que consisten en: determinar el grado de división enzimática de una pluralidad de sustratos para, al menos, una enzima expresada por un microorganismos no identificado en presencia de una concentración eficaz de al menos un efector; identificar dicho microorganismo por comparación del perfil del grado de división enzimática con los perfiles equivalentes de microorganismos conocidos.

El documento FR 2 659 982 divulga un procedimiento de identificación de dos levaduras, caracterizado por que emplea al menos un sustrato cromógeno sensible al menos a una enzima y un sistema de medios inhibidores (característica esencial) . El documento FR 2 659 982 no dice nada acerca del empleo de dos sustratos diferentes para una misma actividad enzimática.

La invención se propone resolver los problemas del estado de la técnica presentando un procedimiento nuevo 50 adaptado particularmente para identificar y discriminar específicamente grupos diferentes de microorganismos, de una manera rápida, poco costosa y fácil de poner en práctica.

De modo sorprendente, los inventores han puesto en evidencia que era posible diferenciar dos grupos de microorganismos que expresan una misma actividad enzimática, mediante la elección juiciosa de una combinación de sustratos específicos de la actividad enzimática expresada por los dos grupos de microorganismos.

Antes de ir más adelante en la exposición de la invención, se proporcionan las definiciones que siguen con la finalidad de facilitar la comprensión de la invención:

En el sentido de la presente invención, el término microorganismo comprende las bacterias, Gram positivas o Gram negativas, las levaduras y más generalmente, los organismos generalmente unicelulares, invisibles a simple vista, que pueden ser multiplicados y manipulados en el laboratorio.

Como bacterias Gram negativas se pueden citar las bacterias de los géneros siguientes: Pseudomonas, Escherichia,

Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Campylobacter, Haemophilus, Morganella, Vibrio, Yersinia, Acinetobacter, Branhamella, Neisseria, Burkholderia, Citrobacter, Hafnia, Edwardsiella, Aeromonas, Moraxella, Pasteurella, Providencia, Actinobacillus, Alcaligenes, Bordetella, Cedacea, Erwinia, Pantoea, Ralstonia, Stenotrophomonas, Xanthomonas y Legionella.

Como bacterias Gram positivas se pueden citar las bacterias de los géneros siguientes: Enterococcus,

Streptococcus, Staphylococcus. Bacillus, Listeria, Clostridium, Gardnerella, Kocuria, Lactococcus, Leuconostoc, Micrococcus, Mycobacteria y Cor y nebacteria.

En calidad de levaduras, se pueden citar las levaduras de los géneros siguientes: Candida, Cr y ptococcus, Rhodotorula, Saccharomyces y Trichosporon.

Por medio de reacción se entiende un medio que comprende todos loe elementos necesarios para la expresión de un metabolismo y/o para el crecimiento de microorganismos. Este medio de reacción puede o bien servir únicamente de medio de revelación, o bien de medio de cultivo y de revelación. En el primer caso, el cultivo de los microorganismos se efectúa antes de la siembra y, en el segundo caso, el medio de reacción constituye igualmente el medio de cultivo. Este medio puede contener otros aditivos eventuales tales como, por ejemplo : peptonas, uno o más factores de crecimiento, hidratos de carbono, uno o varios agentes selectivos, tampones, uno o más agentes gelificantes... . Este medio de reacción puede presentarse en forma de líquido, de gel listo para el empleo, es decir, listo para realizar la siembra en un tubo o un frasco, o en placas de Petri.

Por sustrato enzimático se entiende todo sustrato que puede ser hidrolizado por una enzima dando un producto que permite la detección, directa o indirecta, de un microorganismo. Este sustrato comprende especialmente una primera parte específica de la actividad enzimática a poner de manifiesto y una segunda parte que ejerce el oficio de marcador, denominada a continuación parte marcadora. Esta parte marcadora puede ser cromógena, fluorógena, luminiscente, ... . Como sustrato cromógeno, que se adapta bien a los soportes sólidos (filtro, gelosa, gel de electroforesis) se pueden citar especialmente los sustratos a base de indoxilo y sus derivados, y los sustratos a base de hidroxiquinolina o de esculetina y sus derivados, que permiten la detección de actividades osidasa y esterasa.

A título de sustratos a base de indoxilo, se pueden citar especialmente: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-N-acetil-!-D

glucosamina, 5-bromo-3-indolil-N-acetil-!-D-glucosamina, 6-cloro-3-indolil-N-acetil-!-D-glucosamina, 5-bromo-6cloro-3-indolil-N-acetil-!-D-glucosamina,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento para la identificación de al menos dos grupos de microorganismos que expresan una misma actividad enzimática, que comprende las etapas siguientes:

a) la incubación de dichos grupos de microorganismos en un medio de reacción que comprende un primer 5 sustrato enzimático y un segundo sustrato enzimático, cuyos primer y segundo sustratos enzimáticos están metabolizados por una misma actividad enzimática. b) la identificación de dichos grupos de microorganismos.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, según el cual dicha misma actividad enzimática está escogida entre las actividades enzimáticas siguientes: oxidasa, esterasa y peptidasa.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 ó 2, según el cual el medio de reacción comprende al menos otro sustrato metabolizado por al menos otra actividad enzimática, cuya otra actividad enzimática está escogida preferentemente entre una actividad !-D-glucuronidasa, !-glucosidasa, triptofanasa y desaminasa.


 

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