Procedimiento para la identificación de, al menos, dos grupos de microorganismos.

Procedimiento para la identificación de un primer grupo de microorganismos y de un segundo grupo demicroorganismos que expresan una misma actividad enzimática,

que comprende las etapas siguientes:

a) la incubación de dichos primer y segundo grupos de microorganismos en un medio de reacción quecomprende un primer sustrato enzimático y un segundo sustrato enzimático, cuyos primer y segundosustratos enzimáticos están metabolizados por una misma actividad enzimática.

b) la identificación de dichos grupos de microorganismos.

Procedimiento para la identificación de, al menos, dos grupos de microorganismos La invención se refiere a un procedimiento para la identificación de, al menos, dos grupos de microorganismos que expresan una misma actividad enzimática. La invención se refiere, igualmente, a un medio de reacción particular así 5 como a su utilización para la identificación de, al menos, dos grupos de microorganismos que expresan una misma actividad enzimática.

Desde hace muchos años, se utilizan sustratos enzimáticos particulares para permitir la determinación de la presencia o ausencia de actividades enzimáticas características de microorganismos. Estos sustratos enzimáticos están compuestos, generalmente, de dos partes, una primera parte específica de la actividad enzimática a revelar, 10 llamada igualmente parte diana, y una segunda parte que desempeña el oficio de marcador, llamada parte marcadora, que induce, por ejemplo, una coloración particular de la colonia en el momento de la hidrólisis del sustrato, o la aparición de un precipitado detectable con facilidad. Para la elección de estos sustratos, según que haya reacción o no, por ejemplo una coloración diferente, es posible caracterizar la naturaleza de un microorganismo, o discriminar grupos diferentes de microorganismos. Así pues, en el caso de bacterias, las cepas 15 de Escherichia coli son puestas de manifiesto, frecuentemente, por la revelación de una actividad enzimática de tipo osidasa tal como la actividad !.glucuronidasa o !-galactosidasa. Del mismo modo, el género Listeria puede ser detectado por la puesta de manifiesto de una actividad !-glucosidasa. Se puede citar, igualmente, la detección de una actividad esterasa para, especialmente, la puesta de manifiesto del género Salmonella. En efecto, el género Salmonella posee esterasas inespecíficas capaces de hidrolizar sustratos sintéticos cromógenos, por ejemplo indigogénicos. En el caso de la detección de salmonelas, y más generalmente, en el caso de bacterias con actividad esterasa, la detección y/o la identificación de estas bacterias se lleva a cabo, clásicamente, en medios gelosados que permiten la detección y/o la identificación de colonias sospechosas de bacterias con actividad esterasa.

Sin embargo, una actividad enzimática única no es siempre suficiente para caracterizar un grupo particular de microorganismos de otro grupo de microorganismos. Por ejemplo, si se quiere diferenciar bacterias Gram positivas y 25 bacterias Gram negativas, como por ejemplo las bacterias del grupo KES (Klebsiella, Enterobacter y Serratia, bacterias Gram negativas) , y las del grupo Enterococcus (bacterias Gram positivas) , es necesario detectar varias actividades enzimáticas para acrecentar la especificidad. Conviene, por tanto, combinar varios sustratos enzimáticos en un mismo medio de cultivo, lo que puede ocasionar un elevado coste de fabricación. Además, en ciertos casos, no es posible poner de manifiesto espontáneamente en un mismo medio de reacción, actividades diferentes dado 30 que las condiciones de expresión de las diferentes actividades no son compatibles. Por consiguiente, en el momento de la utilización del medio cromógeno CPS ID 3 comercializado por bioMérieux, tanto las bacterias del grupo KES (Klebsiella, Enterobacter y Serratia, bacterias Gram negativas) , como las del género Enterococcus (bacterias Gram positivas) , detectadas por una actividad osidasa (beta-glucosidasa) producen colonias de color azulverdoso; la distinción entre los dos grupos debe ser confirmada mediante una etapa suplementaria, por un examen microscópico.

La invención se propone resolver los problemas del estado de la técnica presentando un procedimiento nuevo adaptado particularmente para identificar y discriminar específicamente grupos diferentes de microorganismos, de una manera rápida, poco costosa y fácil de poner en práctica.

De modo sorprendente, los inventores han puesto en evidencia que era posible diferenciar dos grupos de 40 microorganismos que expresan una misma actividad enzimática, mediante la elección juiciosa de una combinación de sustratos específicos de la actividad enzimática expresada por los dos grupos de microorganismos.

Antes de ir más adelante en la exposición de la invención, se proporcionan las definiciones que siguen con la finalidad de facilitar la comprensión de la invención:

En el sentido de la presente invención, el término microorganismo comprende las bacterias, Gram positivas o Gram 45 negativas, las levaduras y más generalmente, los organismos generalmente unicelulares, invisibles a simple vista, que pueden ser multiplicados y manipulados en el laboratorio.

Como bacterias Gram negativas se pueden citar las bacterias de los géneros siguientes: Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Campylobacter, Haemophilus, Morganella, Vibrio, Yersinia, Acinetobacter, Branhamella, Neisseria, Burkholderia, Citrobacter, Hafnia, Edwardsiella, Aeromonas,

Moraxella, Pasteurella, Providencia, Actinobacillus, Alcaligenes, Bordetella, Cedacea, Erwinia, Pantoea, Ralstonia, Stenotrophomonas, Xanthomonas y Legionella.

Como bacterias Gram positivas se pueden citar las bacterias de los géneros siguientes: Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus. Bacillus, Listeria, Clostridium, Gardnerella, Kocuria, Lactococcus, Leuconostoc, Micrococcus, Mycobacteria y Cor y nebacteria.

En calidad de levaduras, se pueden citar las levaduras de los géneros siguientes: Candida, Cr y ptococcus, Rhodotorula, Saccharomyces y Trichosporon.

Por medio de reacción se entiende un medio que comprende todos loe elementos necesarios para la expresión de un metabolismo y/o para el crecimiento de microorganismos. Este medio de reacción puede o bien servir únicamente de medio de revelación, o bien de medio de cultivo y de revelación. En el primer caso, el cultivo de los microorganismos se efectúa antes de la siembra y, en el segundo caso, el medio de reacción constituye igualmente el medio de cultivo. Este medio puede contener otros aditivos eventuales tales como, por ejemplo : peptonas, uno o más factores de crecimiento, hidratos de carbono, uno o varios agentes selectivos, tampones, uno o más agentes gelificantes... . Este medio de reacción puede presentarse en forma de líquido, de gel listo para el empleo, es decir, listo para realizar la siembra en un tubo o un frasco, o en placas de Petri.

Por sustrato enzimático se entiende todo sustrato que puede ser hidrolizado por una enzima dando un producto que permite la detección, directa o indirecta, de un microorganismo. Este sustrato comprende especialmente una primera parte específica de la actividad enzimática a poner de manifiesto y una segunda parte que ejerce el orifico de marcador, denominada a continuación parte marcadora. Esta parte marcadora puede ser cromógena, fluorógena, luminiscente, ... . Como sustrato cromógeno, que se adapta bien a los soportes sólidos (filtro, gelosa, gel de electroforesis) se pueden citar especialmente los sustratos a base de indoxilo y sus derivados, y los sustratos a base de hidroxiquinolina o de esculetina y sus derivados, que permiten la detección de actividades osidasa y esterasa.

A título de sustratos a base de indoxilo, se pueden citar especialmente: 5-bromo-4-cloro-3-indolil-N-acetil-!-Dglucosamina, 5-bromo-3-indolil-N-acetil-!-D-glucosamina, 6-cloro-3-indolil-N-acetil-!-D-glucosamina, 5-bromo-6cloro-3-indolil-N-acetil-!-D-glucosamina, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-N-acetil-!-D-galactosamina, 5-bromo-4-cloro-3indolil-!-D-celobiósido, 5-bromo-3-indolil-!-D-celobiósido, 6-cloro-3-indolil-!-D-celobiósido, 5-bromo-6-cloro-320 indolil-!-D-celobiósido, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-!-D-galactósido, 5-bromo-3-indolil-!-D-galactósido, 6-cloro-3indolil-!-D-galactósido, 5-bromo-6-cloro-3-indolil-!-D-galactósido, 6-bromo-3-indolil-!-D-galactósido, 3-indoxil-!-Dgalactósido, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-∀-D-galactósido, 5-bromo-3-indolil-∀-D-galactósido, 6-cloro-3-indolil-∀-Dgalactósido, 5-bromo-6-cloro-3-indolil-∀-D-galactósido, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-!-D-glucósido, 5-bromo-3-indolil-!D-glucósido, 6-cloro-3-indolil.!-D-glucósido, 5-bromo-6-cloro-3-indolil-!-D-glucósido, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-N25 metil-!-D-glucósido, 6-bromo-3-indolil-!-D-glucósido, 3-indoxil-!-D-glucósido, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-∀-Dglucósido, 5-bromo-3-indolil-∀-D-glucósido, 6-cloro-3-indolil-∀-D-glucósido, 5-Bromo-6-cloro-3-indolil-∀-Dglucósido, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-N-metil-∀-D-glucósido, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-!-D-glucurónido, 5-bromo-3indolil-!-D-glucurónido, 6-cloro-3-indolil-!-D-glucurónido, 5-bromo-6-cloro-3-indolil-!-D-glucurónido, 6-bromo-3indolil-!-D-glucurónido,... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la identificación de un primer grupo de microorganismos y de un segundo grupo de microorganismos que expresan una misma actividad enzimática, que comprende las etapas siguientes:

a) la incubación de dichos primer y segundo grupos de microorganismos en un medio de reacción que 5 comprende un primer sustrato enzimático y un segundo sustrato enzimático, cuyos primer y segundo sustratos enzimáticos están metabolizados por una misma actividad enzimática.

b) la identificación de dichos grupos de microorganismos.

2. Utilización de un medio de reacción que comprende al menos un primer sustrato enzimático y al menos un segundo sustrato enzimático, cuyos primer y segundo sustratos enzimáticos están metabolizados por una misma 10 actividad enzimática, para la identificación de un primer grupo de microorganismos y un segundo grupo de microorganismos que expresan una misma actividad enzimática.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o utilización según la reivindicación 2, según el cual dicha misma actividad enzimática se escoge entre las actividades enzimáticas siguientes: oxidasa, esterasa y peptidasa.

4. Procedimiento según la reivindicación 1 o utilización según la reivindicación 2, según el cual:

∃ dicho primer grupo de microorganismos es un grupo de S. aureus y dicho segundo grupo es un grupo de

E. faecalis, ∃ dicha misma actividad enzimática es una actividad alfa-glucosidasa, ∃ dichos primer y segundo sustratos son a base de indoxilo.

5. Procedimiento según la reivindicación 1 o utilización según la reivindicación 2, según el cual:

∃ dichos primer y segundo grupos de microorganismos son salmonelas de serotipos diferentes ∃ dicha misma actividad enzimática es una actividad esterasa, ∃ dichos primer y segundo sustratos son a base de indoxilo.

6. Procedimiento según la reivindicación 1 o utilización según la reivindicación 2, según el cual ∃ dicho primer grupo de microorganismos es un grupo de bacterias Gram + y dicho segundo grupo de microorganismos es un grupo de bacterias Gram -, ∃ dicha misma actividad enzimática es una actividad beta-glucosidasa, ∃ dicho primer sustrato es un derivado de un flavonoide.

7. Procedimiento según la reivindicación 1 o utilización según la reivindicación 2, según el cual: . ∃ dicho primer grupo de microorganismos es un grupo de bacterias Gram + y dicho segundo grupo de microorganismos es un grupo de bacterias Gram -, ∃ dicha misma actividad enzimática es una actividad beta-glucuronidasa, ∃ dicho primer sustrato es a base de naftol y dicho segundo sustrato es a base de indoxilo.

8. Procedimiento según la reivindicación 1 o utilización según la reivindicación 2, según el cual:. . ∃ dicho primer grupo de microorganismos es un grupo de levaduras y dicho segundo grupo de microorganismos es un grupo de bacterias, ∃ dicha misma actividad enzimática es una actividad hexosaminidasa, ∃ dicho primer sustrato es a base de alizarina y dicho segundo sustrato es a base de indoxilo.

9. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 a 8, según el cual el medio de reacción comprende al menos otro sustrato metabolizado por al menos otra actividad enzimática, cuya otra actividad 40 enzimática está escogida preferentemente entre una actividad !-D-glucuronidasa, !-glucosidasa, triptofanasa o desaminasa.

10. Utilización según una cualquiera de las reivindicaciones 2, 3 a 8, según la cual el medio de reacción comprende al menos otro sustrato metabolizado por al menos otra actividad enzimática, cuya otra actividad enzimática está escogida preferentemente entre una actividad !-D-glucuronidasa, !-glucosidasa, triptofanasa o desaminasa.