GENES GRG23 Y GRG51 QUE CONFIEREN RESISTENCIA A LOS HERBICIDAS.

Una molécula aislada de ácido nucleico seleccionada entre:

a) una molécula de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos:

1, 3 ó 5, o un complemento de la misma;

b) una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, que codifica a una EPSPS de tolerancia al glifosato, o un complemento de la misma;

c) la secuencia de nucleótidos de tolerancia al glifosato del inserto de ADN del plásmido depositado como el Acceso No. NRRL B-30888 o B-30949, o un complemento de la misma:

d) una molécula de ácido nucleico que codifica a un polipéptido que contiene las secuencias de aminoácidos SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6; y

e) una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6, en donde dicho polipéptido tiene actividad de tolerancia al glifosato

Tipo: Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: W06045908US.

Solicitante: ATHENIX CORPORATION.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 108 T W ALEXANDER DRIVE PO BOX 110347,RESEARCH TRIANGLE PARK, NC 277.

Inventor/es: CARR, BRIAN, PETERS,CHERYL,L, HINSON,JILL, HAMMER,PHILIP,E, VANDE BERG,BRIAN, SCHOUTEN,LAURA,COOPER.

Fecha de Publicación: 3 de Febrero de 2010.

Fecha Concesión Europea: 26 de Agosto de 2009.

Clasificación Internacional de Patentes:

C07K14/415 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de vegetales.
C12Q1/42 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › fosfatasa.

Clasificación PCT:

A01H5/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A01 AGRICULTURA; SILVICULTURA; CRIA; CAZA; CAPTURA; PESCA. › A01H NOVEDADES VEGETALES O PROCEDIMIENTOS PARA SU OBTENCION; REPRODUCCION DE PLANTAS POR TECNICAS DE CULTIVO DE TEJIDOS. › Angiospermas,es decir, plantas con flores, caracterizadas por sus partes vegetales; Angiospermas caracterizadas de forma distinta que por su taxonomía botánica.
C12N15/54 C12 […] › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Transferasas (2).
C12N15/82 C12N 15/00 […] › para células vegetales.
C12N5/10 C12N […] › C12N 5/00 Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales, p. ej. líneas celulares; Tejidos; Su cultivo o conservación; Medios de cultivo para este fin (reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00). › Células modificadas por introducción de material genético extraño, p. ej. células transformadas por virus.
C12N9/10 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Transferasas (2.) (ribonucleasas C12N 9/22).
C12Q1/48 C12Q 1/00 […] › en los que interviene una transferasa.

Fragmento de la descripción:

Genes GRG23 y GRG51 que confieren resistencia a los herbicidas.

Campo de la invención

Esta invención proporciona nuevos genes que codifican tolerancia al glifosato que son útiles en biología de las plantas, reproducción de cultivos y cultivo de células de plantas.

Antecedentes de la invención

La N-fosfonometilglicina, comúnmente denominada glifosato, es un importante compuesto químico agronómico. El glifosato inhibe a la enzima que convierte al ácido fosfoenolpirúvico (PEP) y al ácido 3-fosfoshiquímico (S3P) en ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshiquímico. La inhibición de esta enzima (5-enolpiruvilshiquimato-3-fosfato sintasa, denominada aquí como "EPSPS") mata las células de las plantas cerrando la ruta del shiquimato, inhibiendo así la biosíntesis del ácido aromático.

Ya que los herbicidas de la clase del glifosato inhiben la biosíntesis de aminoácidos aromáticos, no solamente matan células de plantas, sino que también son tóxicos para las células bacterianas. El glifosato inhibe muchas EPSP sintasas bacterianas, y por lo tanto es tóxico para estas bacterias. Sin embargo, ciertas EPSP sintasas bacterianas tienen una alta tolerancia al glifosato.

Las células de las plantas resistentes a la toxicidad del glifosato pueden ser producidas por medio de células de plantas transformantes para expresar EPSP sintasas bacterianas resistentes al glifosato. Notablemente el gen bacteriano de la cepa CP4 de Agrobacterium tumefaciens ha sido utilizado para conferir resistencia a los herbicidas en células de plantas después de la expresión en plantas. Una EPSP sintasa mutada de la cepa CT7 de Salmonella typhymurium confiere resistencia al glifosato en células bacterianas, y confiere resistencia al glifosato sobre células de plantas (patentes estadounidenses Nos. 4.535.060; 4.769.061 y 5.094.945). Sin embargo, existe la necesidad de otros genes resistentes a herbicidas.

Se puede analizar la actividad cinética de EPSPS midiendo la liberación de fosfato. Se detecta la liberación de fosfato utilizando un ensayo acoplado para la detección de fluorescencia del fosfato con base en la generación de N-acetil-3,7-dihidroxifenoxacina (Amplex® Red), como se conoce en el estado del arte (Vázquez y colaboradores (2003) Analytical Biochemestry 320: 292-298). Las condiciones publicadas del ensayo pueden conducir a saturación del ensayo en experimentos donde se libera fosfato muy rápidamente. Se requieren métodos adicionales para la medición de la actividad cinética de EPSPS.

Resumen de la invención

Se proporcionan composiciones y métodos para conferir a las bacterias, plantas, células de plantas, tejidos, semillas, tolerancia al glifosato. Las composiciones incluyen moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos para tolerancia al glifosato, vectores que incluyen aquellas moléculas de ácido nucleico, y células huésped que contienen a tales vectores. Las composiciones también incluyen anticuerpos para los polipéptidos de tolerancia al glifosato. Como se ha señalado, las secuencias de nucleótidos de la invención pueden ser utilizadas en construcciones de ADN o casetes de expresión para transformación y expresión en organismos, incluidos microorganismos y plantas. Las composiciones también incluyen bacterias, plantas, células de plantas, tejidos y semillas trasformados. Además, se proveen métodos para producir los polipéptidos codificados por los nucleótidos sintéticos de la invención.

Se proporcionan moléculas aisladas de ácido nucleico y variantes de las mismas que codifican polipéptidos para tolerancia al glifosato. Adicionalmente, están incluidas las secuencias de aminoácidos y las variantes de las mismas codificadas por lo polinucleótidos que confieren tolerancia al glifosato. La presente invención proporciona moléculas aisladas de ácido nucleico que contienen una secuencia de nucleótidos expuesta en las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6, a la secuencia de nucleótidos para tolerancia al glifosato depositada en un huésped bacteriano con los Números de Acceso NRRL B-30888 o NRRL B-30949, así como variantes y fragmentos de las mismas. Las secuencias de nucleótidos que son complementarias a una secuencia de nucleótidos de la invención, o que hibridan a una secuencia de la invención están también incluidas.

Los métodos para medir la actividad cinética de la enzima que utilizan sustratos fluorogénicos son también suministrados.

Por lo tanto, la presente invención proporciona una molécula aislada de ácido nucleico, una molécula aislada de ácido nucleico seleccionada entre:

a) una molécula de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, o un complemento de la misma;

b) una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, que codifica a una EPSPS de tolerancia al glifosato, o un complemento de la misma;

c) la secuencia de nucleótidos de tolerancia al glifosato del inserto de ADN del plásmido depositado como el Acceso No. NRRL B-30888 o B-30949, o un complemento de la misma:

d) una molécula de ácido nucleico que codifica a un polipéptido que contiene las secuencias de aminoácidos SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6; y

e) una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6, en donde dicho polipéptido tiene actividad de tolerancia al glifosato.

La invención también proporciona:

- un vector que contiene una molécula de ácido nucleico de la invención, conteniendo dicho vector opcionalmente una molécula de ácido nucleico que codifica a un polipéptido heterólogo.

- una célula huésped que contiene a tal vector;

- una planta transgénica que contiene a la célula huésped; o

- una semilla transformada de tal planta.

La invención proporciona adicionalmente un polipéptido aislado seleccionado entre:

a) un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6;

b) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5;

c) un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6, en donde dicho polipéptido tiene actividad de tolerancia al glifosato;

d) un polipéptido que es codificado por una secuencia de nucleótidos que es al menos 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, en donde dicho polipéptido tiene actividad de tolerancia al glifosato; y

e) un polipéptido que es codificado por la secuencia de nucleótidos para tolerancia al glifosato del inserto de ADN del plásmido depositado como el Acceso No. NRRL B-30888 o NRR B-30949;dicho polipéptido comprende opcionalmente además una secuencia heteróloga de aminoácidos.

La invención proporciona además un método para producir un polipéptido con actividad de tolerancia al glifosato, que comprende el cultivo de la célula huésped de la invención bajo condiciones en las cuales se expresa una molécula de ácido nucleico que codifica al polipéptido, siendo dio polipéptido seleccionado del grupo que consiste de:

a) un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6;

b) un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5;

c) un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con un polipéptido con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6, en donde dicho polipéptido tiene actividad de tolerancia al glifosato;

d)...

Reivindicaciones:

1. Una molécula aislada de ácido nucleico seleccionada entre:

a) una molécula de ácido nucleico que contiene la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, o un complemento de la misma;

c) la secuencia de nucleótidos de tolerancia al glifosato del inserto de ADN del plásmido depositado como el Acceso No. NRRL B-30888 o B-30949, o un complemento de la misma:

d) una molécula de ácido nucleico que codifica a un polipéptido que contiene las secuencias de aminoácidos SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6; y

2. La molécula aislada de ácido nucleico de la reivindicación 1, en donde dicha secuencia de nucleótidos es una secuencia sintética que ha sido diseñada para expresión en una planta.

3. Un vector que comprende a la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1; dicho vector comprendiendo opcionalmente adicionalmente una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido heterólogo.

4. Una célula huésped que contiene al vector de la reivindicación 3.

5. Una célula huésped de la reivindicación 4 que es una célula huésped bacteriana o una célula de una planta.

6. Una planta transgénica que comprende a la célula huésped de la planta de la reivindicación 5, o una semilla transformada de dicha planta.

7. Un polipéptido aislado seleccionado entre:

a) un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6;

b) un polipéptido codificado por la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5;

8. Un método para la producción de un polipéptido con actividad de tolerancia al glifosato, que comprende el cultivo de la célula huésped de la reivindicación 4 bajo condiciones en las cuales se expresa una molécula de ácido nucleico que codifica al polipéptido, siendo dicho polipéptido seleccionado del grupo que consiste de:

a) un polipéptido que contiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6;

b) un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5;

d) un polipéptido codificado por una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con la secuencia de ácido nucleico de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, en donde dicho polipéptido tiene actividad de tolerancia al glifosato; y

e) un polipéptido que es codificado por la secuencia de nucleótidos para tolerancia al glifosato del inserto de ADN del plásmido depositado como el Acceso No. NRRL B-30888 o NRR B-30949.

9. Un método para conferir tolerancia al glifosato en una planta, dicho método comprendiendo la transformación de dicha planta con una construcción de ADN, dicha construcción comprendiendo un promotor que dirige la expresión en una célula de una planta operativamente enlazada con una secuencia de nucleótidos al menos 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos.: 1, 3 ó 5 que codifican una EPSPS de tolerancia al glifosato y que regeneran una planta transformada.

10. Una planta o célula de una planta que tiene incorporada en forma estable en su genoma una construcción de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína que tiene actividad de tolerancia al glifosato, en donde dicha secuencia de nucleótidos es seleccionada de:

a) una secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5;

b) una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 80% de identidad de secuencia con una secuencia de nucleótidos de las SEQ ID Nos: 1, 3 ó 5, en donde dicha secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido que tiene actividad de tolerancia al glifosato;

c) una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6;

d) una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 2, 4 ó 6, en donde dicho polipéptido tiene actividad de tolerancia al glifosato; y

e) la secuencia de nucleótidos de tolerancia al glifosato del inserto de ADN del plásmido depositado como el Acceso No. NRRL B-30888 o NRRL B-30949; en donde dicha secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un promotor que dirige la expresión de una secuencia de codificación en una célula de una planta.

11. Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica a una enzima EPSPS de tolerancia al glifosato, en donde dicha enzima EPSPS de tolerancia al glifosato tiene una Km para el fosfoenolpiruvato (PEP) entre 1 y 150 uM y una K_i (glifosato)/K_m (PEP) entre aproximadamente 500 y aproximadamente 1000.

12. Una planta que tiene incorporada en forma estable en su genoma una construcción de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica a un polipéptido EPSPS, teniendo dicho polipéptido EPSPS una Km para PEP entre 1 y 150 uM y una K_i (glifosato)/K_m (PEP) entre 500 y 1000, exhibiendo dicha planta tolerancia al herbicida glifosato.

13. La planta de la reivindicación 12, donde dicha planta es una planta de soja o una planta de maíz.

14. La planta de la reivindicación 6 u 11, en donde dicha planta es una planta de maíz, sorgo, trigo, girasol, tomate, crucíferas, pimientos, patata, algodón, arroz, soja, remolacha azucarera, caña de azúcar, tabaco, cebada, o colza oleaginosa.

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