Medio de detección de Streptococcus agalatiae utilizando la actividad esterasa.

Medio de reacción que comprende (i) un sustrato enzimático de esterasa que el Streptococcus agalactiae no es capaz de utilizar en menos de 18h después de la inoculación,

(ii) un sustrato enzimático seleccionado entre los sustratos de β-celobiosidasa, los sustratos de N-acetil-glucosaminidasa y los sustratos de β-glucosidasa, y (iii) un sustrato de fosfatasa

Medio de detección de Streptococcus agalatiae utilizando la actividad esterasa La presente invención se refiere al campo de la detección y de la identificación de Streptococcus agalactiae. Más particularmente, la invención se refiere a la utilización de sustratos de esterasa, eventualmente en asociación con al menos un sustrato de ï?¡-glucosidasa, de fosfatasa de ï?¢-celobiosidasa o de N-acetil-glucosaminidasa, para la detección y la identificación de Streptococcus agalactiae.

El género Streptococcus comprende numerosas especies muy extendidas en la naturaleza, en la piel y las mucosas del hombre y de los animales y son el origen de múltiples infecciones. Son bacterias ubicuistas que se encuentra en estado libre en el medio exterior (suelo, aire, agua) , en estado saprófito o en estado de comensal en el ser humano y los animales. Sus localizaciones son la rinofaringe para los estreptococos de los grupos A, C, G, H y salivarius, el intestino para los estreptococos fecales del grupo D y la cavidad vaginal para los estreptococos del grupo B. Su papel patógeno es extremadamente variado y depende de las especies en cuestión y de su localización en el organismo.

Los estreptococos son unos cocos Gram+, de 0, 5 a 1 ï?­m de diámetro, que presentan un grupo en cadena e inmóviles. Catalasa negativa, con metabolismo fermentador, son anaeróbicos facultativos y son sensibles a las variaciones de temperatura (crecimiento óptimo 37º C) y a las variaciones de pH (pH óptimo de 7) .

Streptococcus agalactiae (o estreptococo B) está reconocido como uno de los principales agentes infecciosos responsables de la mamitis en los bóvidos. En el hombre, es esencialmente un saprófito de las vías genitales de la mujer (vagina) , pero se encuentra también en la rinofaringe y en el intestino, en particular en el recto. En los adultos, la colonización sigue siendo a menudo asintomática, pero el Streptococcus agalactiae puede ser responsable de septicemias, de neumonías, de meningitis, de artritis, de infecciones urinarias y de supuraciones profundas. En la mujer embarazada o después del parto, la infección puede conducir a unas endometritis y a una esterilidad.

En el recién nacido, la contaminación se produce in utero o, generalmente, durante el parto por inhalación del líquido amniótico o de secreciones vaginales. Una infección precoz aparece a menudo a partir del nacimiento o en las primeras horas de vida. La infección precoz es favorecida por la premadurez, la ruptura de las membranas y una fuerte colonización de la vagina de la madre. La tasa de mortalidad en este tipo de infección es muy elevada (> del 50%) . Las infecciones tardías se traducen generalmente en una meningitis (meningitis del lactante) y en artritis.

El cribado sistemático de los portadores de Streptococcus agalactiae se recomienda en final del embarazo, idealmente entre las 34 y 38 semanas de amenorrea (35-37 semanas de embarazo) , debido, en particular, a su predominio (10% en Francia, es decir al menos 75000 mujeres embarazadas/año) y de sus consecuencias durante los partos a término, lo que provoca un problema de salud pública.

Los medios selectivos y/o los medios que permiten una orientación del diagnóstico están disponibles en el comercio. Sin embargo, estos medios tienen como inconveniente que no son suficientes por sí solos para el diagnóstico de Streptococcus agalactiae y que es necesario efectuar unas pruebas complementarias, tales como la puesta en evidencia del antígeno del grupo B de Lancefield (polisacárido con presencia dominante de ramnosa) y la hidrólisis del hipurato (caldo de hipurato) .

Los medios selectivos más habitualmente utilizados son el caldo de Todd-Hewitt, el caldo de enriquecimiento destinado a la búsqueda de los estreptococos del grupo B en la mujer embarazada. Este caldo contiene diferentes antibióticos que inhiben la mayoría de los gérmenes Gram negativos de la flora acompañante, tales como el ácido nalixídico y la gentamicina, o el ácido nalixídico, la polimixina y el cristal violeta.

Después de la etapa de enriquecimiento, el caldo de Todd-Hewitt complementado con antibióticos debe ser traspasado sobre unos medios destinados a la búsqueda de los estreptococos (véanse las recomendaciones del CDC (Center for Disease Control) , MMWR (Morbidity and Mortality Weekly Report) , 16 de agosto de 2002, Vol. 51, nº RR-11) .

El medio de Lim es una variante del caldo de Todd-Hewitt, y contiene el 1% de extracto de levadura, ácido nalixídico y colistina.

También se utiliza una gelosa Columbia que contiene el 5% de sangre y permite en particular la puesta en evidencia del carácter ï?¢-hemolítico de Streptococcus agalactiae. Sin embargo, este carácter no aparece siempre: el halo de hemólisis alrededor de las colonias puede ser estrecho, dando más bien el aspecto ï?¡-, incluso ï?§-hemolítico. Por el contrario, este carácter se vuelve claro si en las proximidades de las colonias de Streptococcus agalactiae se encuentran unas colonias de Staphylococcus aureus (Factor Camp) .

Estos medios selectivos tienen como inconveniente que deben ser completados por unos ensayos bioquímicos y/o inmunológicos.

Actualmente, el único medio selectivo listo para el empleo disponible en el comercio, que permite el aislamiento y la identificación directa de Streptococcus agalactiae a partir de extracciones recto-vaginales es el medio Granada (Biolys SA) . Este medio tiene como característica que favorece la producción de un pigmento carotenoide por las cepas de Streptococcus agalactiae debido a la presencia en el medio de almidón soluble, proteosa peptona nº 3, glucosa, piruvato de sodio, sulfato de magnesio, metotrexato, colistina, cristal violeta, agar, suero de caballo, Na2HPO4 anhidro, metronidazol, MOPS (ácido morfolinopropanosulfónico) hemisódico, agua destilada e incubación en anaerobiosis. Este medio tiene por lo tanto como inconveniente que la detección directa de Streptococcus agalactiae se realiza en condición anaerobia, lo que no es fácil de realizar. Por otra parte, no está disponible ningún medio de detección que contenga uno o más sustratos enzimáticos.

El documento EP 1 293 575 describe un sistema de ensayos universales para la identificación de múltiples familias de microorganismos. Así, este documento realiza un catálogo que mezcla en dos largas listas los microorganismos detectables y los sustratos enzimáticos utilizables. El documento EP 1 293 575 sugiere al experto en la materia la combinación de sustrato siguiente: peptidasa + glicosidasa + ureasa + triptofanasa + esterasa + descarboxilasa. Además, en este documento, se encuentra una gran lista de microorganismos a detectar.

El documento EP0881284 describe un medio de cultivo para la detección específica de las enterobacterias. El documento EP0881284 muestra la detección de las salmonelas y de otras enterobacterias utilizando el medio BKD1, que contiene un sustrato de esterasa, y que esta detección les es específica, ya que este medio no permite detectar otras cepas, tales como Streptococcus spp.

El documento FR2708286 describe un medio de cultivo que comprende al menos dos cromógenos. Unos ejemplos de tales cromógenos son descritos en el documento FR2708286. Este documento describe un número importante de sustratos potenciales. Pero, el documento FR2708286 no describe ni ilustra la detección de Streptococcus agalactiae. El documento FR2708286 ilustra sólo la detección de los estreptococos D.

La solicitante ha puesto ahora en evidencia, contra toda lo esperado, que era posible utilizar unos sustratos enzimáticos, en particular unos sustratos enzimáticos de esterasa, para la detección específica y la identificación de Streptococcus agalactiae.

En efecto, de manera sorprendente, la solicitante ha puesto en evidencia que sólo los Streptococcus agalactiae entre las especies de bacterias más próximas y más frecuentemente encontradas de manera asociada no eran capaces de utilizar los sustratos enzimáticos de esterasa de manera precoz (a menos de 18h después de la inoculación) , de manera que son las únicas que no se revelan de manera precoz por los sustratos de esterasa, por ejemplo, no obteniendo ninguna modificación de las colonias en el medio de manera precoz, por ejemplo no obteniendo modificación alguna de la coloración de las colonias en el medio cuando se utiliza un sustrato de esterasa cromogénico, sin que la coloración se difunda en el medio de reacción, por lo tanto, concentrada a nivel de las colonias, sin que por ello las moléculas tengan un efecto nefasto sobre su crecimiento.

En consecuencia, este sustrato enzimático tiene como ventaja suplementaria que la lectura de los resultados puede realizarse... [Seguir leyendo]

1. Medio de reacción que comprende (i) un sustrato enzimático de esterasa que el Streptococcus agalactiae no es capaz de utilizar en menos de 18h después de la inoculación, (ii) un sustrato enzimático seleccionado entre los sustratos de ï?¢-celobiosidasa, los sustratos de N-acetil-glucosaminidasa y los sustratos de ï?¢-glucosidasa, y (iii) un sustrato de fosfatasa.

2. Medio de reacción según la reivindicación 1, caracterizado por que el sustrato (ii) es un sustrato de βcelobiosidasa.

3. Medio de reacción según la reivindicación 1, caracterizado por que el sustrato (ii) es un sustrato de N-acetilglucosaminidasa.

4. Medio de reacción según la reivindicación 1, caracterizado por que el sustrato (ii) es un sustrato de β-glucosidasa.

5. Medio de reacción según la reivindicación 4, caracterizado por que el sustrato β-glucosidasa es un sustrato de indoxilo.

6. Medio de reacción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que el sustrato de esterasa se selecciona ente los derivados de indoxilo octanoato, de indoxilo nonanoato y de indoxilo decanoato.

7. Medio de reacción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado por que la concentración en cada sustrato enzimático está comprendida entre 10 y 2000 mg/l.

8. Medio de reacción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado por que comprende también unas soluciones fosfato.

9. Medio de reacción según la reivindicación 8, caracterizado por que las soluciones fosfato se seleccionan entre 20 Na2HPO4 y K2HPO4.

10. Medio de reacción según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que comprende también una mezcla de inhibidores para inhibir o limitar el crecimiento de las cepas indeseables.

11. Medio de reacción según la reivindicación 10, caracterizado por que los inhibidores son unos antibióticos.

12. Medio de reacción según la reivindicación 11, caracterizado por que los antibióticos son Aztreonam y anfotericina 25 B.