ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS PARA ELEGIR COMO DIANA CÉLULAS QUE PARTICIPAN EN REACCIONES DE TIPO ALÉRGICO, COMPOSICIONES Y USOS DE LOS MISMOS.

Un anticuerpo biespecífico o cualquier fragmento de unión del mismo que comprende:

(i) un primer componente de reconocimiento diana que se une específicamente a la IRp60 del receptor inhibidor; y

(ii) un segundo componente de reconocimiento diana que se une específicamente a un marcador específico para un mastocito, un eosinófilo y/o un basófilo, en el que dicho marcador es un activador o un receptor cuya ruta de transducción de señales se inhibe por la activación de dicho receptor inhibidor y en el que dicho marcador se selecciona del grupo que consiste en inmunoglobulinas, receptores de Fc, receptores de citocinas, receptores de factores de crecimiento, moléculas de adhesión, receptores de la superfamilia de las Ig, receptores de quimiocinas, receptor de mediadores inflamatorios, receptores de hormonas, receptores de factores del complemento, receptores activados por proteasa y enzimas y en el que dicha IRp60 del receptor inhibidor y dicho marcador están presentes en una única célula.

Anticuerpos biespecíficos para elegir como diana células que participan en reacciones de tipo alérgico, composiciones y usos de los mismos La presente invención se refiere a un anticuerpo biespecífico o a cualquier fragmento de unión del mismo según la reivindicación 1, a una composición farmacéutica según la reivindicación 12, al uso de al menos uno de los anticuerpos biespecíficos según la reivindicación 14.

La presente invención se refiere al campo de la inmunofarmacología. Más específicamente, la presente invención se refiere a una molécula biespecífica que hace de modulador de inflamación alérgica, siendo una herramienta tanto preventiva como terapéutica.

Antecedentes de la invención OTT V.L. y col. se refiere a “Activating and inhibitor y signaling in mast cells: new opportunities for terapheutic intervention”, Journal of allergy and clinical immunology, Mosby, libro anual, Inc, US, vol. 106, nº 3. Septiembre de 2000, páginas 429-440.

El documento WO 03/064662 A desvela moléculas biespecíficas que pueden reticular receptores de ITAM y ITIM sobre una célula con el fin de inhibir la activación de la célula, además de enfoques de terapia génica usando nucleótidos que codifican tales moléculas biespecíficas para la expresión in vivo. Un ejemplo de un par de receptores ITAM/ITIM es Fc epsilon RI y HM18, y otro es Fc epsilon RI y Fc gamma RII. La reticulación de estos receptores con una molécula biespecífica conduciría a la inhibición de la liberación de mediadores alérgicos y a la mejora de los síntomas de enfermedades alérgicas. Otras enfermedades pueden mejorarse por reticulación de pares de receptores ITIM/ITAM.

A. Inflamación alérgica La inflamación alérgica es un fenómeno complejo que implica diversos tipos de células tales como células inflamatorias y estructurales. Los mastocitos son los iniciadores bien establecidos de inflamación alérgica, atracción, activación y finalmente interacción con otras células inflamatorias, principalmente los eosinófilos. La inflamación alérgica comprende una variedad de patologías tales como asma, rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, eczema atópico, etc. Entre estas enfermedades, y como un ejemplo, el asma es la enfermedad más común de la primera infancia, representando hasta el 20% en países occidentales y aumentando actualmente [Busse WW, Lemanske RF Jr. (2001) N Engl J Med. 344:3501].

La experimentación en el campo de la alergia ha proporcionado percepciones de mecanismos celulares y moleculares subyacentes a estas patologías. Estas investigaciones han conducido al entendimiento de que la respuesta alérgica es frecuentemente bifásica. La primera fase temprana se inicia por la activación de mastocitos (véase más adelante) , mientras que la segunda fase tardía se provoca por la infiltración de células inflamatorias, predominantemente linfocitos T, eosinófilos y algunos basófilos [Broide DH, Firestein GS. (1991) J Clin Invest. 88:10482]. Sin embargo, el conocimiento todavía no ha proporcionado medios terapéuticos eficaces. Los enfoques actualmente usados ofrecen tanto alivio sintomático (es decir, antihistamínicos y antileucotrienos) como un tratamiento antiinflamatorio no selectivo (es decir, glucocorticosteroides) . Además, los tratamientos inmunofarmacológicos recientemente desarrollados que eligen como diana un único anticuerpo (por ejemplo, IgE) , citocina de linfocitos T (por ejemplo, anti-IL-5) o varios factores de transcripción (por ejemplo, STAT-6, GATA-3 o FOG-1) todavía no han demostrado ser eficaces.

B. Mastocitos Los mastocitos son la morada de tejido, células que llevan FcεRI que contienen gránulos citoplásmicos importantes. Además de tener una función fundamental en las reacciones alérgicas, también participan en fibrosis, tumores, enfermedades autoinmunitarias e inmunidad innata. Los mastocitos están ampliamente distribuidos por todo el cuerpo, en tejidos conjuntivos y sobre las superficies de la mucosa en la que normalmente se localizan en estrecha proximidad a los vasos sanguíneos y los nervios periféricos. Por tanto, se exponen a estímulos medioambientales tales como microorganismos y alergenos con los que pueden reaccionar, tanto dentro de minutos como durante un periodo de horas, y experimentar la secreción regulada de mediadores previamente formados y recientemente sintetizados.

Tras la activación, los mastocitos liberan una variedad de mediadores inflamatorios que incluyen constituyentes de gránulos previamente formados (por ejemplo, histamina, proteoglicanos y proteasas) , PGD2, LTC4, PAF y, a un menor grado, LTB4, y una variedad de citocinas (por ejemplo IL-1, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-13, RANTES, IFN-γ, TGF-β, TNF-α, y GM-CSF) [Puxeddu I. y col. (2003) Int J Biochem Cell Biol. 35:16013].

Además de la activación de mastocitos clásica dependiente de IgE “alérgica” que es desencadenada por la unión de alergenos a dos moléculas de IgE adyacentes unidas a FcεRI, hay otras formas de estimulación de mastocitos. La activación de mastocitos independiente de IgE puede ser particularmente importante en el marco de la fase tardía y en inflamación crónica. Notablemente, aunque la terapia con anti-IgE se ha aprobado ahora para el tratamiento de asma, sólo induce una modesta mejora. Esto pone de relieve la participación de rutas dependientes de no IgE en el desarrollo de asma, además de la necesidad de nuevas dianas para intervención terapéutica. De hecho, el trabajo hecho en el laboratorio de los inventores (además de en otros) ha mostrado que numerosos mediadores pueden activar mastocitos [Piliponsky A.M. y col. (2003) Blood 101:1898-4; Feldweg, A. M. y col. (2003) Eur. J. Immunol. 33:2262-8]. Entre ellos, el factor de citoblasto (SCF) , que es fundamentalmente responsable de la diferenciación, supervivencia, proliferación, maduración, quimiotaxia, adhesión, además de la activación, de mastocitos y el factor de crecimiento nervioso (NGF) que también induce activación de mastocitos.

La estimulación de mastocitos independiente de IgE también puede desencadenarse por compuestos polibásicos que comparten características estructurales similares esenciales para su actividad tales como el compuesto 48/80, neuropéptidos (VIP, CGRP, sustancia P, neurotensina) y proteína básica mayor (MBP) derivada de eosinófilos [Piliponsky A.M. y col. (2003) id ibíd].

Los eosinófilos son granulocitos derivados de la médula ósea que se diferencian bajo la regulación de los factores de transcripción GATA-1 y 2 y c/EBP, y las citocinas IL-3, GM-CSF y IL-5 (“citocinas de supervivencia de eosinófilos”) [Kaatz Maa y col. (2004) Int. J. Mol. Med. 14:1055-160]. Notablemente, las células CD4+ Th2 son los principales productores de estas citocinas [Umland SP y col. (1998) Am J Respir Cell Mol Biol 18:631-42]. Los eosinófilos entran normalmente en la sangre y migran en el tracto gastrointestinal, pero en estados inflamatorios pueden acumularse en diversos tejidos. Aquí pueden sobrevivir durante varios días debido a efectos de las “citocinas de supervivencia” localmente liberadas antes de que se produzca la muerte celular programada. Los eosinófilos están asociados a mecanismos de defensa del huésped en infestaciones parasíticas y participan en la patogénesis de trastornos alérgicos, inmunológicos y malignos, además de en una variedad de síndromes hipereosinofílicos idiopáticos [Bain, B.J. (2004) Am J Hematol 77:82-5; Klion, A.D. y col. (2004) J. Allergy Clin. Immunol. 113:30-7]. En LAR (respuesta asmática tardía) , los eosinófilos pueden ser responsables de la lesión a tejido (principalmente epitelial) mediante la liberación de sus proteínas granulares citotóxicas. Además, la prueba es la emergencia de eosinófilos de implicación como células efectoras que participan en la reparación de tejido y la fibrosis asociada a asma [Levi-Schaffer, F. y col. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:9660-5].

Los eosinófilos almacenan mediadores de gránulos previamente formados, como la proteína básica mayor (MBP) , proteína catiónica de eosinófilos (ECP) , neurotoxina derivada de eosinófilos (EDN) y peroxidasa de eosinófilos (EPO) ; sintetizan mediadores de lípidos como PAF, LTC4 y PGE2, además de citocinas y quimiocinas proinflamatorias e inmunorreguladoras como IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-13, IL-16, GM-CSF, SCF, NGF, TNF-α, TGF-β, INF-γ, MIP-1, RANTES y eotaxina [Piliponsky, A.M. y col. (2002) Mol Immunol 38:1369]. Se encontró que las proteínas básicas de eosinófilos eran altamente tóxicas in vitro... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo biespecífico o cualquier fragmento de unión del mismo que comprende:

(i) un primer componente de reconocimiento diana que se une específicamente a la IRp60 del receptor inhibidor; y

(ii) un segundo componente de reconocimiento diana que se une específicamente a un marcador específico para un mastocito, un eosinófilo y/o un basófilo, en el que dicho marcador es un activador o un receptor cuya ruta de transducción de señales se inhibe por la activación de dicho receptor inhibidor y en el que dicho marcador se selecciona del grupo que consiste en inmunoglobulinas, receptores de Fc, receptores de citocinas, receptores de factores de crecimiento, moléculas de adhesión, receptores de la superfamilia de las Ig, receptores de quimiocinas, receptor de mediadores inflamatorios, receptores de hormonas, receptores de factores del complemento, receptores activados por proteasa y enzimas

y en el que dicha IRp60 del receptor inhibidor y dicho marcador están presentes en una única célula.

2. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1, en el que dicho primer y segundo componentes de reconocimiento diana están ligados mediante uno cualquiera de un reticulador, un compuesto ligador, un vehículo, un espaciador sintético, un sustrato de inmovilización y un motivo (Gly4Ser) 3 basado en la región flexible.

3. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1, en el que dicho primer y segundo componentes de reconocimiento diana están reticulados.

4. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1-3, en el que dicho componente de reconocimiento se selecciona de uno cualquiera de un anticuerpo que se produce naturalmente, sintético o recombinante, Fv monocatenario (scFv) , scFv bifuncional, diacuerpo, unidad F (ab) , unidad F (ab') , conjugado de F (ab') biespecífico, anticuerpo bifuncional químicamente reticulado, anticuerpo lineal, fragmento de unión a antígeno F (ab') 2 de un anticuerpo, o cualquier fragmento funcional los mismos.

5. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1-4, en el que dicho componente de reconocimiento es una unidad F (ab') .

6. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1-5, en el que dicho marcador es uno de IgE, cKIT, IL-5R, CCR3 y FcεRI.

7. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1, en el que dicho marcador es IgE.

8. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1, en el que dicho marcador es c-KIT.

9. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1, en el que dicho marcador es FCSRI.

10. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1, en el que dicho marcador es CCR3.

11. El anticuerpo biespecífico de la reivindicación 1, en el que dicho marcador es IL-5R.

12. Una composición farmacéutica que comprende como agente activo al menos uno del complejo biespecífico de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

13. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende además tampones, aditivos, estabilizadores, diluyentes y/o excipientes.

14. Uso de al menos uno de los anticuerpos biespecíficos de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de cualquier enfermedad o afección seleccionada del grupo que consiste en: alergia, asma alérgico, rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, dermatitis atópica y eczema atópico, trastornos alérgicos y respuestas a diversos alergenos, anafilaxia sistémica, mastocitosis sistémica, morfea/urticaria pigmentosa, leucemia de mastocitos, aterosclerosis, rechazo de injerto, esclerosis múltiple, enfermedades pulmonares fibróticas, neurofibromatosis, queloides, esclerodermia, artritis reumatoide, osteoartritis, gota aguda, penfigoide cicatricial ocular, enfermedad de Crohn, adhesiones peritoneales, enfermedad crónica de injerto frente a huésped (GVHD) , síndrome de eosinofilia-mialgia, asma bronquial, poliposis nasal, granulomatosis de Wegener, enfermedades pulmonares intersticiales y otras enfermedades pulmonares, neumonía eosinofílica crónica, neumonitis por hipersensibilidad, aspergilosis broncopulmonar alérgica, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopática, enfermedades neoplásicas y mieloproliferativas, linfomas de linfocitos T y enfermedad de Hodgkin.

15. El uso de la reivindicación 14, en el que la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en asma bronquial extrínseco, rinitis alérgica, dermatitis oncocerquiana, dermatitis atópica, poliposis nasal, nódulos, eosinofilia, reumatismo, dermatitis e hinchazón (NERDS) , enfermedades granulomatosas vasculíticas, vasculitis temporal, síndrome de Churg-Strauss, poliarteritis, granulomatosis de Wegener, esclerosis múltiple, rechazo de injerto, asma bronquial, enfermedades pulmonares intersticiales y otras enfermedades pulmonares, efusiones pleurales

eosinofílicas, infiltrados eosinofílicos pulmonares transitorios (Löffler) , histiocitosis, neumonía eosinofílica crónica, neumonitis por hipersensibilidad, aspergilosis broncopulmonar alérgica, fibrosis pulmonar idiopática, eosinofilia tópica, enfermedad del arañazo de gato, tuberculosis afebril, neumonía por clamidia en la infancia, enfermedades neoplásicas y mieloproliferativas, carcinoma broncogénico, síndrome hipereosinofílico, linfomas de linfocitos T y enfermedad de Hodgkin, enfermedad de Crohn, queratoconjuntivitis primaveral, nevo por conjuntivitis inflamada juvenil, enfermedad de Kimura, enfermedad de Gleich.