PROTEÍNAS OLIGOMÉRICAS TIPO CHAPERONA, ESTABLES A DESNATURALIZANTES Y/O RESISTENTES A PROTEASA, POLINUCLEÓTIDOS QUE CODIFICAN LAS MISMAS Y SUS USOS.

Proteínas oligoméricas tipo chaperona, estables a desnaturalizantes y/o resistentes a proteasa, polinucleótidos que codifican las mismas y sus usos. La presente invención se refiere a una construcción de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1, una célula transformada con una construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, un organismo no humano transformado con la construcción de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10, un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido aislado estable a ebullición y estable a detergentes de acuerdo con la reivindicación 12, un procedimiento para estabilizar a una proteína frente a condiciones desnaturalizantes de acuerdo con la reivindicación 13, una proteína de fusión que comprende un polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes de acuerdo con la reivindicación 14, una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 20 y reivindicación 25, un procedimiento para proteger a una preparación enzimática de la reducción en la actividad enzimática de acuerdo con la reivindicación 21, una planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 22, un procedimiento para volver a una planta más tolerante a un estrés biótico o abiótico de acuerdo con la reivindicación 23, uso de un polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes de acuerdo con la reivindicación 24, un procedimiento para aumentar la avidez de unión de una molécula de unión de acuerdo con la reivindicación 28, un heterocomplejo de acuerdo con la reivindicación 32. La presente invención se refiere a proteínas oligoméricas tipo chaperona, estables a desnaturalizantes (por ejemplo, ebullición, detergentes, otros desnaturalizantes) y/o resistentes a proteasa, polinucleótidos que codifican las mismas y usos de las mismas. Más particularmente, la presente invención se refiere a nuevas proteínas homo-oligoméricas estables a desnaturalizantes, resistentes a proteasas compuestas por homo-monómeros, mencionándose dichas proteínas a partir de ahora en este documento como proteínas estables (PE), procedimientos de producción y purificación de PE, construcciones de ácido nucleico que codifican PE, anticuerpos que reconocen PE, el uso de PE para estabilizar, replegar y desagregar, en otras palabras, realizar la función chaperona sobre, macromoléculas tales como proteínas, proteínas de fusión que incluyen PE, construcciones de ácido nucleico que codifican estas proteínas de fusión, su uso en inmunización y/o formación de estructuras complejas homogéneas o heterogéneas y otras aplicaciones. Chaperonas moleculares: Las chaperonas moleculares se caracterizan por su remarcable capacidad de reconocer selectivamente y unirse a proteínas inestables, organizadas de forma no nativa (a partir de ahora no nativas). Las interacciones de las chaperonas con dichas proteínas dirigen múltiples (diversas) funciones que son específicas para diferentes chaperonas, incluyendo: facilitar y promover el plegamiento de proteínas nacientes en su conformación final, albergar sustratos en una forma no estructurada que es competente para el transporte a través de la membrana, mantener las proteínas en conformaciones específicas, evitar la agregación de proteínas no plegadas, y promover la renaturalización de proteínas agregadas. Las últimas dos funciones son particularmente importantes para células que experimentan altas temperaturas y otros estreses. Por lo tanto, no es sorprendente que muchas chaperonas moleculares se identificaran por primera vez como proteínas de choque térmico (Hsp). Proteínas de choque térmico (Hsp): ES 2 365 602 T3 Las Hsp son un grupo de proteínas encontradas en todos los organismos expuestos a temperaturas de estrés. Se ha demostrado claramente que muchas Hsp tienen las actividades de chaperonas moleculares que están implicadas en el plegamiento apropiado de polipéptidos nacientes y ayudan a las proteínas dañadas a volver a conseguir su conformación biológicamente activa (Hartl, 1996). Las Hsp pequeñas (sHsp) son Hsp que tienen un tamaño molecular que varía de 12-40 kDa en diferentes organismos, y que se encuentran abundantemente en plantas. La sHsp vegetal como otras sHsp y las alfa cristalinas tienden a formar grandes complejos oligoméricos que se creen que es su forma funcional (Chen y col., 1994; Lee y col., 1995; Collada y col., 1997). Suzuki y col. (1998) proporcionaron evidencias de que la Hsp21 localizada en cloroplasto del guisante existe como un complejo y no se disocia durante el estrés térmico y la recuperación. En contraste con las Hsp vegetales, las sHsp citosólicas de mamífero experimentan disociación de los complejos en monómeros por fosforilación durante el estrés térmico (Rogalla y col., 1999). Un artículo reciente de Haslbeck y col., (1999) demostró que la disociación del complejo Hsp26 de la levadura está regulado por la temperatura y es un prerrequisito para la actividad eficaz de la chaperona. Se ha demostrado que in vitro, las sHsp se unen a proteínas no nativas (Lee y col., 1995, Ehrnsperger y col., 1997, Veinger y col., 1998), por lo tanto, evitan la agregación de proteínas no nativas, permitiendo el posterior replegamiento por la red de chaperonas (Ehrnsperger y col., 1997, Veinger y col., 1998; Haslbeck y col., 1999). En general, las Hsp son estables a temperaturas moderadas pero no a temperaturas que exceden de 80ºC. La acumulación de Hsp18.1 del guisante sigue siendo estable con una vida media de 38 horas a 38ºC. A 55ºC, el efecto de la Hsp18.1 para evitar la agregación de LDH desnaturalizado por calor era menor que a 45ºC (Lee y col., 1995). El oligómero Hsp25 era estable a 43ºC hasta 60 minutos (Ehrnsperger y col., 1997). La exposición de Hsp21 a temperaturas por encima de 70ºC condujo a una agregación irreversible (Hrndahl y col., 1999). El único informe de una Hsp altamente estable al calor es Hsp12 de levaduras (Praekelt y Meacock, 1990). En base a sus propiedades físico-químicas y la similitud de la composición de aminoácidos, Mtwisha y col., (1998) sugirieron que Hsp12 es una 2 proteína tipo LEA. No se ha informado de que ningún complejo oligomérico de sHsp sea estable en desnaturalización con SDS. Todas las sHsp presentadas se verificaron como monómeros en SDS-PAGE, salvo que la proteína estuviera reticulada. Usos de Hsp y moléculas tipo chaperona: La capacidad única de las proteínas de estrés para estabilizar estructuras proteicas y peptídicas se ha empleado para modificar la antigenicidad de péptidos, para proteger a células del estrés oxidativo y térmico, para alterar la agregación de las proteínas y para promover el plegamiento proteico in vitro. La capacidad de las Hsp de ejecutar la conformación de antígenos ha conducido a varias aplicaciones propuestas, incluyendo la incorporación de Hsp70, Hsp90 y gp 76 en vacunaciones usando antígenos tumorales no antigénicos (Patente de Estados Unidos Nº 6.162.436 de Srivastava), para provocar la inmunidad contra agentes de enfermedad infecciosa (Patente de Estados Unidos Nº 6.139.841 de Srivastava) y la supresión del rechazo de aloinjertos y xenoinjertos a través de la modulación de la respuesta inmune del injerto tisular (Patente de Estados Unidos Nº 5.891.653 de Attfield). La expresión de elevado nivel de secuencias de ADN clonadas que codifican Hsp se ha empleado para conferir una nueva resistencia a estrés en las células transformadas. Hsp27 humana sobreexpresada protegía a células 1929 y 13.S. 1.24 transformadas del estrés oxidativo (Rogalla, T., y col., JBC (1999) 274, 18947-56). La sHsp Cs Hsp 17.5 derivada de plantas (de cotiledones de castaño), cuando se expresaba en E. coli transformada, protegía a las bacterias contra extremos de frío (4ºC) y calor (50ºC) (Soto-A, y col., Plant Physiology (1999) 120, 521-528). La alfa-beta cristalina del cristalino también se considera una proteína sHsp. Cuando se expresaba una secuencia de ADN que codifica la proteína cristalina en células propensas a la formación de agregados amiloides, la sHsp evitaba la formación de fibrillas in vitro. Sin embargo, esta desagregación aumentaba en lugar de disminuir la toxicidad de la proteína beta amiloide. (Stege, G. J. y col., Biochem. y Biophys. Res. Comm. (1999) 262 (1): 152- 6). Las proteínas estructurales se han empleado exitosamente en el ensamblaje in vitro de proteínas de la cápsida viral (Newcomb, WW. y col., Journal of Virology (1999) 73, 4231-50); para promover el plegamiento preciso de las proteínas in vitro y en sistemas de expresión heterólogos (véase, la Patente de Estados Unidos Nº 5.561.221 de Yoshida y col.) y para promover la respuesta inmunológica presentando una pluralidad de antígenos en la misma partícula (Gonzalo y col., J. Mol. Biol (2001) 305, 259-267). Ninguna de... [Seguir leyendo]

1.- Una construcción de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que comprende: (a) un primer polinucleótido que codifica una proteína estable a ebullición, estable a detergentes, o resistente a proteasa, teniendo dicha proteína una actividad tipo chaperona y en el que dicha proteína estable tiene una secuencia al menos un 65% homóloga a la SEC ID Nº 2 ó 35, determinada usando el software BestFit del paquete de análisis de secuencia Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, donde la penalización por creación de hueco es igual a 8 y la penalización por extensión de hueco es igual a 2; y (b) un segundo polinucleótido que incluye una secuencia promotora que está unida de forma funcional a dicho primer polinucleótido para dirigir la expresión de dicha proteína. 2.- La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que: (i) dicho promotor vegetal constitutivo se selecciona entre el grupo que consiste en el promotor vegetal CaMV35S, el promotor vegetal CaMV19S, el promotor vegetal FMV34S, el promotor vegetal del badnavirus baciliforme de la caña de azúcar, el promotor vegetal CsVMV, el promotor vegetal de la actina ACT2/ACT8 de Arabidopsis, el promotor vegetal UBQ1 de la ubiquitina de Arabidopsis, el promotor vegetal BTH6 de la tionina de la hoja de la cebada, y el promotor vegetal de la actina del arroz; (ii) dicho promotor vegetal específico de tejido se selecciona entre el grupo que consiste en el promotor vegetal de la proteína de almacenamiento de la faseolina de la alubia, el promotor vegetal DLEC, el promotor vegetal PHS, el promotor vegetal de la proteína de almacenamiento de zeína, el promotor vegetal de la conglutina gamma de la soja, el promotor vegetal del gen AT2S1, el promotor vegetal de la actina ACT11 de Arabidopsis, el promotor vegetal napA de Brassica napus y el promotor vegetal del gen de la patatina de la patata; y (iii) dicho promotor vegetal inducible se selecciona entre el grupo que consiste en un promotor vegetal inducible por la luz derivado del gen rbcS del guisante, un promotor vegetal del gen rbcS de la alfalfa, los promotores vegetal DRE, MYC y MYB que son activos en sequía; los promotores vegetal INT, INPS, prxEa, Ha hsp17.7G4 y RD21 activos en elevada salinidad y estrés osmótico, y los promotores vegetal hsr203J y str246C activos en estrés patogénico. 3.- La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que dicha secuencia promotora es un promotor procariota. 4.- La construcción de ácido nucleico de la reivindicación 1, en la que dicha proteína estable de forma nativa es un oligómero. 5.- La construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicha proteína estable tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 2. 6.- La construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicha proteína estable tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 35. 7.- La construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicho primer polinucleótido tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 1. 8.- La construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicho primer polinucleótido tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 34. 9.- Una célula transformada con la construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-8. 10.- Un organismo no humano transformado con la construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-9. 11.- La construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende adicionalmente (c) un tercer polinucleótido que codifica una proteína adicional, estando adyacente dicho tercer polinucleótido y en fase con dicho primer polinucleótido, codificando dicho primer y tercer polinucleótidos, en combinación, una proteína de fusión de dicha proteína estable y dicha proteína adicional. 12.- Un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes aislado, y/o un polipéptido resistente a proteasa, teniendo dicho polipéptido una actividad tipo chaperona y teniendo una secuencia al menos un 65% homóloga la SEC ID Nº 2 ó 35, determinada usando el software BestFit del paquete de análisis de secuencia Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, donde la penalización por creación de hueco es igual a 8 y la penalización por extensión de hueco es igual a 2. 13.- Un procedimiento para estabilizar una proteína contra condiciones desnaturalizantes que comprende causar que una cantidad eficaz de un polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes, y/o un polipéptido resistente a 58 ES 2 365 602 T3 proteasa llegue ha estar en contacto con dicha proteína, teniendo dicho polipéptido una actividad tipo chaperona y teniendo una secuencia al menos un 65% homóloga a la SEC ID Nº 2 ó 35, determinada usando el software BestFit del paquete de análisis de secuencia Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, donde la penalización por creación de hueco es igual a 8 y la penalización por extensión de hueco es igual a 2. 14.- Una proteína de fusión que comprende un polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes, y/o un polipéptido resistente a proteasa, teniendo dicho polipéptido una actividad tipo chaperona y teniendo una secuencia al menos un 65% homóloga a la SEC ID Nº 2 ó 35, determinada usando el software BestFit del paquete de análisis de secuencia Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, donde la penalización por creación de hueco es igual a 8 y la penalización por extensión de hueco es igual a 2, fusionado a un polipéptido adicional. 15.- La proteína de fusión de la reivindicación 14, en la que dicho polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes y/o resistente a proteasa que tiene dicha actividad tipo chaperona está fusionado a dicho polipéptido adicional mediante un enlace peptídico. 16.- La proteína de fusión de la reivindicación 14 ó 15, en la que dicho polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes y/o resistente a proteasa que tiene dicha actividad tipo chaperona está fusionado a dicho polipéptido adicionalmente mediante un enlazador. 17.- La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 14-16, que tiene una forma oligomérica. 18.- La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 14-17, en la que dicho polipéptido estable tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 2. 19.- La proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 14-18, en la que dicho polipéptido estable tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 35. 20.- Una composición farmacéutica que comprende la proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 14-19 y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 21.- Un procedimiento para proteger una preparación enzimática de la reducción en la actividad enzimática, comprendiendo el procedimiento añadir a la preparación enzimática un polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes, y/o un polipéptido resistente a proteasa que tiene una actividad tipo chaperona y que tiene una secuencia al menos un 65% homóloga a la SEC ID Nº 2 ó 35, determinada usando el software BestFit del paquete de análisis de secuencia Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, donde la penalización por creación de hueco es igual a 8 y la penalización por extensión de hueco es igual a 2, en una cantidad suficiente para proteger la preparación enzimática de la reducción en la actividad enzimática. 22.- Una planta transgénica transformada con la construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-8. 23.- Un procedimiento para volver a una planta más tolerante a un estrés biótico o abiótico, comprendiendo el procedimiento modificar la planta para que exprese la construcción de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-8. 24.- Uso de un polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes, y/o un polipéptido resistente a proteasa para la preparación de un medicamento para acelerar la cicatrización de heridas, teniendo dicho polipéptido una actividad tipo chaperona y teniendo una secuencia al menos un 65% homóloga a la SEC ID Nº 2 ó 35, determinada usando el software BestFit del paquete de análisis de secuencia Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, donde la penalización por creación de hueco es igual a 8 y la penalización por extensión de hueco es igual a 2. 25.- Una composición farmacéutica, que comprende, como ingrediente activo, un polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes, y/o un polipéptido resistente a proteasa, teniendo dicho polipéptido una actividad tipo chaperona y teniendo una secuencia al menos un 65% homóloga a la SEC ID Nº 2 ó 35, determinada usando el software BestFit del paquete de análisis de secuencia Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, donde la penalización por creación de hueco es igual a 8 y la penalización por extensión de hueco es igual a 2, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 26.- La composición de la reivindicación 25, en la que dicho polipéptido estable tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 2. 27.- La composición de la reivindicación 25, en la que dicho polipéptido estable tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 35. 28.- Un procedimiento para aumentar la avidez de unión de una molécula de unión, comprendiendo el procedimiento presentar múltiples copias de la molécula de unión sobre la superficie de un oligómero de un polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes, y/o un polipéptido resistente a proteasa, teniendo dicho polipéptido una actividad tipo chaperona y teniendo una secuencia al menos un 65% homóloga a la SEC ID Nº 2 ó 35, determinada usando el software BestFit del paquete de análisis de secuencia Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, 59 ES 2 365 602 T3 donde la penalización por creación de hueco es igual a 8 y la penalización por extensión de hueco es igual a 2. 29.- El procedimiento de la reivindicación 28, en el que dicha molécula de unión se selecciona entre el grupo que consiste en un receptor, un ligando, una enzima, un sustrato, un inhibidor, un anticuerpo y un antígeno. 30.- El procedimiento de la reivindicación 28 ó 29, en el que dicho polipéptido estable tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 2. 31.- El procedimiento de las reivindicaciones 28-29, en el que dicho polipéptido estable tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 35. 32.- Un heterocomplejo que comprende un oligómero que incluye una pluralidad de un polipéptido estable a ebullición y estable a detergentes, y/o un polipéptido resistente a proteasa, teniendo dicho polipéptido una actividad tipo chaperona y teniendo una secuencia al menos un 65% homóloga a la SEC ID Nº 2 ó 35, determinada usando el software BestFit del paquete de análisis de secuencia Wisconsin, utilizando el algoritmo de Smith y Waterman, donde la penalización por creación de hueco es igual a 8 y la penalización por extensión de hueco es igual a 2, y al menos dos moléculas diferentes que están fusionadas a dicho oligómero. 33.- La composición de la reivindicación 32, en la que dicho polipéptido estable tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 2. 34.- La composición de la reivindicación 32, en la que dicho polipéptido estable tiene la secuencia expuesta en la SEC ID Nº 35. ES 2 365 602 T3 61 ES 2 365 602 T3 62 ES 2 365 602 T3 63 ES 2 365 602 T3 64 ES 2 365 602 T3 ES 2 365 602 T3 66 ES 2 365 602 T3 67 ES 2 365 602 T3 68 ES 2 365 602 T3 69 ES 2 365 602 T3 ES 2 365 602 T3 71 ES 2 365 602 T3 72 ES 2 365 602 T3 73 ES 2 365 602 T3 74 ES 2 365 602 T3 ES 2 365 602 T3 76 ES 2 365 602 T3 77 ES 2 365 602 T3 78