Sistema de detección de la reacción en cadena de la polimerasa.

Un método para la detección de un producto de extensión de cebador,

comprendiendo el método las etapas de:

a) proporcionar uno o más grupos de oligonucleótidos cebadores, comprendiendo cada grupo uno o más conjuntos de oligonucleótidos cebadores, cada conjunto estando caracterizado por

i) un primer oligonucleótido cebador que tiene una porción específica de diana y una porción secuencia arriba en dirección 5' específica del casete de fluorescencia, y

ii) un segundo oligonucleótido cebador que tiene una porción específica de diana

en donde los oligonucleótidos cebadores de un conjunto concreto son adecuados respectivamente para la hibridación en cadenas complementarias de una secuencia de nucleótidos diana correspondiente para permitir la formación de un producto de extensión de cebador, por ejemplo, un producto de PCR y en donde el primer oligonucleótido cebador de cada conjunto del mismo grupo contiene una porción específica de casete de fluorescencia que es capaz de hibridar con el complemento de la porción específica de casete de fluorescencia del primer oligonucleótido cebador de cualquier conjunto del mismo grupo

b) proporcionar uno o más conjuntos de oligonucleótidos de casete, cada conjunto estando caracterizado por

i) un primer oligonucleótido del casete marcado con un resto fluorescente que es un resto donador y consiste en una secuencia capaz de hibridar con el complemento de la porción específica del casete de fluorescencia del primer oligonucleótido cebador de cualquier conjunto en un grupo de oligonucleótidos cebadores determinado, y que no comprende una porción de una secuencia específica de diana; y

ii) un segundo oligonucleótido del casete marcado con un resto aceptor (por ejemplo, un resto desactivador), en donde el segundo oligonucleótido del casete no comprende una secuencia específica de diana y en donde el segundo oligonucleótido del casete es entre 1 y 5 bases de nucleótidos más corto que el primer oligonucleótido del casete correspondiente;

donde cada conjunto de oligonucleótidos del casete hibridan entre sí para formar un par fluorescente desactivado, en donde el par fluorescente desactivado tiene una Tm A,

c) iniciar la reacción de extensión del cebador, generando de esta manera una secuencia complementaria al primer oligonucleótido cebador relevante (si el polinucleótido diana relevante está presente), de tal manera que, el segundo oligonucleótido del casete relevante es menos capaz de hibridar con el primer oligonucleótido del casete relevante, de manera que se genera una señal; y

d) detectar la señal que se genera,

en donde la reacción de extensión del cebador se realiza, al menos en parte, a una Ta que es menor que la Tm A o las Tm A para dicho uno o más pares fluorescentes desactivados.