Método para la cuantificación relativa de cambios en la metilación del ADN, usando reacciones combinadas de nucleasa, ligamiento, y polimerasa.

Un método para identificar, en una muestra que se ha obtenido,

una o más moléculas de ácido nucleico diana que se diferencian de otras moléculas de ácido nucleico de la muestra en uno o más restos metilados, comprendiendo dicho método:

someter una o más moléculas de ácido nucleico diana en la muestra a al menos una reacción de digestión enzimática insensible a la metilación y al menos una reacción de digestión enzimática sensible a la metilación para formar una pluralidad de productos de digestión;

desnaturalizar los productos de digestión para formar productos de digestión monocatenarios;

proporcionar una pluralidad de adaptadores de oligonucleótido, comprendiendo cada adaptador de oligonucleótido una primera parte específica de cebador y un extremo en la posición 3', dicho extremo en la posición 3' configurado para ligarse a una parte en la posición 5' de un producto de digestión monocatenario e hibridado a su complemento, en donde el complemento del extremo en la posición 3' está acoplado a una región de oligonucleótido que es complementaria a una parte en la posición 5' del producto de digestión monocatenario, extendiéndose dicha parte a través de la secuencia de digestión enzimática insensible a la metilación del producto de digestión monocatenario;

someter los productos de digestión a una reacción de ligamiento que comprende un tratamiento de hibridación, en el que cada uno de los productos de digestión monocatenarios se hibridan a su región complementaria del complemento de adaptador de oligonucleótido de una manera específica de secuencia de modo que el extremo en la posición 3' del adaptador es adyacente al extremo en la posición 5' del producto de digestión monocatenario, y a un tratamiento de ligamiento, en el que el extremo en la posición 3' del adaptador de oligonucleótido se liga al extremo la posición 5' del producto de digestión monocatenario adyacente formando de ese modo productos de digestión etiquetados con adaptador;

proporcionar uno o más conjuntos de cebador de oligonucleótido primario, comprendiendo cada conjunto de cebador primario (i) un primer cebador de oligonucleótido primario que comprende una secuencia de nucleótidos que es la misma que la primera parte específica de cebador de los productos de digestión etiquetados con adaptador y (ii) un segundo cebador de oligonucleótido primario que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a una región del producto de digestión que está en la posición 3' con respecto a uno o más sitios de restricción metilados, sin escindir, y una segunda parte específica de cebador;

mezclar la pluralidad de productos de digestión etiquetados con adaptador, el uno o más conjuntos de cebador de oligonucleótido primario y una primera polimerasa para formar una primera mezcla de reacción en cadena de la polimerasa;

someter la primera mezcla de reacción en cadena de la polimerasa a uno o más ciclos de reacción en cadena de la polimerasa que comprenden un tratamiento de desnaturalización, un tratamiento de hibridación y un tratamiento de extensión formando de ese modo productos primarios de extensión; y

detectar y distinguir los productos primarios de extensión, identificando de ese modo la presencia de una o más moléculas de ácido nucleico diana que se diferencian de otras moléculas de ácido nucleico en la muestra en uno o más restos metilados.