Métodos de ensamblaje dinámico de vectores para la clonación de ADN de vectores plasmídicos.

Un método para sintetizar simultáneamente una matriz de transgenes,

que comprende las etapas de:

a. proporcionar un vector plasmídico de clonación primario que comprende un armazón, comprendiendo el armazón

(i) al menos un primer punto de acoplamiento y un segundo punto de acoplamiento estando cada punto de acoplamiento fijado en el armazón y que comprenden al menos un sitio de restricción raro de más de 6 nucleótidos para una enzima de restricción rara no variable y

(ii) un único sitio para HE en orientación directa localizado secuencia arriba desde el extremo 5' del primer punto de acoplamiento y un único sitio para HE en orientación inversa localizado secuencia abajo desde el extremo 3' del segundo punto de acoplamiento;

b. escindir el primer punto de acoplamiento con una primera enzima de restricción rara no variable que se corresponde con uno de los sitios de restricción raros de más de 6 nucleótidos del primer punto de acoplamiento;

c. escindir el segundo punto de acoplamiento con una segunda enzima de restricción rara no variable que se corresponde con uno de los sitios de restricción del segundo punto de acoplamiento;

d. proporcionar al menos una inserción de Promotor que comprende una secuencia de Promotor de interés, con un extremo 5' que es compatible con el extremo 3' del primer punto de acoplamiento;

e. proporcionar al menos una inserción de Expresión que comprende una secuencia de Expresión de interés, con un extremo 5' que es compatible con el extremo 3' de la al menos una inserción de Promotor para formar un sitio de restricción raro de más de 6 nucleótidos para una tercera enzima de restricción rara no variable;

f. proporcionar al menos una inserción Reguladora que comprende una secuencia Reguladora de interés, con un extremo 5' que es compatible con el extremo 3' de la al menos una inserción de Expresión para formar un sitio de restricción raro de más de 6 nucleótidos para una cuarta enzima de restricción rara no variable, y un extremo 3' que es compatible con el extremo 5' del segundo punto de acoplamiento que se escindió en la etapa `c', en donde la primera, la segunda, la tercera y la cuarta enzimas de restricción raras no variables son diferentes;

g. colocar al menos dos tipos diferentes de al menos una de las inserciones de Promotor, de Expresión y Reguladora, al menos una de cada una de las inserciones restantes y el vector plasmídico de clonación escindido en una mezcla de reacción apropiada para producir la unión simultánea, la auto-orientación y la colocación secuencial de cada una de las inserciones de Promotor, de Expresión y Reguladora entre el primer y el segundo puntos de acoplamiento del armazón, creando de esta manera una matriz de plásmidos que tienen diferentes combinaciones de inserciones de Promotor, de Expresión y Reguladoras en su armazón;

m. escindir el armazón en cada uno de los sitios para HE únicos con una enzima de restricción HE única;

n. purificar la parte escindida que contiene las inserciones; y

o. insertar la parte escindida en un genoma huésped de interés.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E11009458.

Solicitante: INTREXON CORPORATION.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 1750 Kraft Drive, Suite 1400 Blacksburg, VA 24060 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: REED,THOMAS,D.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07H21/04 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07H AZUCARES; SUS DERIVADOS; NUCLEOSIDOS; NUCLEOTIDOS; ACIDOS NUCLEICOS (derivados de ácidos aldónicos o sacáricos C07C, C07D; ácidos aldónicos, ácidos sacáricos C07C 59/105, C07C 59/285; cianohidrinas C07C 255/16; glicales C07D; compuestos de constitución indeterminada C07G; polisacáridos, sus derivados C08B; ADN o ARN concerniente a la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos o su aislamiento, preparación o purificación C12N 15/00; industria del azúcar C13). › C07H 21/00 Compuestos que contienen al menos dos unidades mononucleótido que tienen cada una grupos fosfato o polifosfato distintos unidos a los radicales sacárido de los grupos nucleósido, p. ej. ácidos nucleicos. › con desoxirribosilo como radical sacárido.
  • C12N15/09 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12N15/11 C12N 15/00 […] › Fragmentos de ADN o de ARN; sus formas modificadas (ADN o ARN no empleado en tecnología de recombinación C07H 21/00).
  • C12N15/63 C12N 15/00 […] › Introducción de material genético extraño utilizando vectores; Vectores; Utilización de huéspedes para ello; Regulación de la expresión.
  • C12N15/64 C12N 15/00 […] › Métodos generales para la preparación del vector, para su introducción en la célula o para la selección del huésped que contiene el vector.
  • C12N15/66 C12N 15/00 […] › Métodos generales para insertar un gen en un vector para formar un vector recombinante, utilizando la escisión y la unión; Utilización de "linkers" no funcionales o de adaptadores, p. ej. "linkers" que contienen la secuencia para una endonucleasa de restricción.
  • C12N15/85 C12N 15/00 […] › para células animales.
  • C12P19/34 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › Polinucleótidos, p. ej. ácidos nucleicos, oligorribonucleótidos.

PDF original: ES-2603062_T3.pdf

 

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