Ligandos de diacilhidrazina para modular la expresión de genes exógenos en sistemas de mamífero a través de un complejo de receptor de ecdisona.

Compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

a) N-terc-butil-N'-(3-hidroximetil-5-metil-2,

3-dihidro-benzo[1,4]dioxin-6-carbonil)-hidrazida del 5 ácido 3,5-dimetilbenzoico, b) N-terc-butil-N'-[3-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-5-metil-2,3-dihidro-benzo[1,4]dioxin-6-carbonil]-hidrazida del ácido 3,5-dimetil-benzoico,

c) ácido 7-[N'-terc-butil-N'-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazinocarbonil]-8-metil-2,3-dihidro-benzo[1,4]dioxin-2-carboxílico,

d) éster metílico del ácido 7-[N'-terc-butil-N'-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazinocarbonil]-8-metil-2,3-dihidrobenzo[ 1,4]dioxin-2-carboxílico,

e) N-terc-butil-N'-(3-semicarbazidometil-5-metil-2,3-dihidro-benzo[1,4]dioxin-6-carbonil)-hidrazida del ácido 3,5- dimetil-benzoico,

f) éster 7-[N'-terc-butil-N'-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazinocarbonil]-8-metil-2,3-dihidro-benzo[1,4]dioxin-2-ilmetílico del ácido fenil-carbámico,

g) N'-[3-(2-amino-etil)-5-metil-2,3-dihidro-benzo[1,4]dioxin-6-carbonil]-N-terc-butil-hidrazida del ácido 3,5-dimetilbenzoico,

h) éster pentafluorofenílico del ácido 7-[N'-terc-butil-N'-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazinocarbonil]-8-metil-2,3-dihidrobenzo[ 1,4]dioxin-2-carboxílico,

i) metilamida del ácido 7-[N'-terc-butil-N'-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazinocarbonil]-8-metil-2,3-dihidro-benzo[1,4]dioxin- 2-carboxílico,

j) N-terc-butil-N'-(3-formil-5-metil-2,3-dihidro-benzo[1,4]dioxin-6-carbonil)-hidrazida del ácido 3,5-dimetil-benzoico,

k) éster 7-[N'-terc-butil-N'-(3,5-dimetil-benzoil)-hidrazinocarbonil]-8-metil-2,3-dihidro-benzo[1,4]dioxin-2-ilmetílico del ácido tolueno-4-sulfónico,

l) N-terc-butil-N'-[3-(hidroxiimino-metil)-5-metil-2,3-dihidro-benzo[1,4]dioxin-6-carbonil]-hidrazida del ácido 3,5-dimetilbenzoico, m) N-terc-butil-N'-(3-cianometil-5-metil-2,3-dihidro-benzo[1,4]dioxin-6-carbonil)-hidrazida del ácido 3,5-dimetil40 benzoico,

n) N-terc-butil-N'-(5-metil-3-metilsulfanilmetil-2,3-dihidro-benzo[1,4]dioxin-6-carbonil)-hidrazida del ácido 3,5-dimetilbenzoico,

o) N-terc-butil-N'-(3-metanosulfonilmetil-5-metil-2,3-dihidro-benzo[1,4]dioxin-6-carbonil)-hidrazida del ácido 3,5- dimetil-benzoico, y

p) N-terc-butil-N'-(3-fluorometil-5-metil-2,3-dihidro-benzo[1,4]dioxin-6-carbonil)-hidrazida del ácido 3,5-dimetilbenzoico.

Ligandos de diacilhidrazina para modular la expresión de genes exógenos en sistemas de mamífero a través de un complejo de receptor de ecdisona Esta solicitud reivindica prioridad sobre la solicitud provisional estadounidense nº 60/446.233 presentada el 10/2/2003.

Campo de la invención Esta invención se refiere al campo de la biotecnología o ingeniería genética. Específicamente, esta invención se refiere al campo de la expresión génica. Más específicamente, esta invención se refiere a ligandos no esteroideos tal como se define en la reivindicación 1 para receptores nucleares naturales y mutados y a su uso en la modulación de la expresión de un gen dentro de una célula huésped.

Antecedentes de la invención En el presente documento se citan diversas publicaciones. Sin embargo, la mención de cualquier referencia en el presente documento no debe considerarse un reconocimiento de que tal referencia está disponible como “técnica anterior” a la presente solicitud.

En el campo de la ingeniería genética, el control preciso de la expresión génica es una herramienta valiosa para estudiar, manipular y controlar el desarrollo y otros procesos fisiológicos. La expresión génica es un proceso biológico complejo que implica varias interacciones proteína-proteína específicas. Con el fin de desencadenar la expresión génica, de manera que produzca el ARN necesario como primera etapa en la síntesis de proteínas, debe llevarse un activador de la transcripción a las proximidades de un promotor que controla la transcripción génica. Normalmente, el propio activador de la transcripción está asociado con una proteína que tiene al menos un dominio de unión a ADN que se une a sitios de unión del ADN presentes en las regiones promotoras de los genes. Por tanto, para que se produzca la expresión génica, una proteína que comprende un dominio de unión a ADN y un dominio de transactivación ubicado a una distancia apropiada del dominio de unión a ADN debe llevarse a la posición correcta en la región promotora del gen.

El enfoque transgénico tradicional utiliza un promotor específico del tipo celular para dirigir la expresión de un transgén diseñado. En primer lugar, se incorpora un constructo de ADN que contiene el transgén en un genoma huésped. Cuando se desencadena por un activador de la transcripción, se produce la expresión del transgén en un tipo celular dado.

Otro medio para regular la expresión de genes foráneos en células es a través de promotores inducibles. Los ejemplos del uso de tales promotores inducibles incluyen el promotor PR1-a, sistemas de represor-operador de procariotas, sistemas de inmunosupresor-inmunofilina y sistemas de activación de la transcripción de eucariotas superiores tales como sistemas de receptores de hormonas esteroideas y se describen a continuación.

El promotor PR1-a del tabaco se induce durante la respuesta de resistencia sistémica adquirida tras el ataque de patógenos. El uso de PR1-a puede estar limitado porque a menudo responde a materiales endógenos y factores 45 externos tales como patógenos, radiación UV-B y contaminantes. Se han descrito sistemas de regulación génica basados en promotores inducidos por choque térmico, interferón y metales pesados (Wurn et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5414-5418; Arnheiter et al., 1990 Cell 62:51-61; Filmus et al., 1992 Nucleic Acids Research 20:27550-27560) . Sin embargo, estos sistemas tienen limitaciones debido a su efecto sobre la expresión de genes no diana. Estos sistemas también son rezumantes.

Los sistemas de represor-operador de procariotas utilizan proteínas represoras bacterianas y secuencias de ADN de operador único a las que se unen. Se han usado los sistemas de represor-operador tanto de tetraciclina (“Tet”) como de lactosa (“Lac”) de la bacteria Escherichia coli en plantas y animales para controlar la expresión génica. En el sistema Tet, la tetraciclina se une a la proteína represora TetR, dando como resultado un cambio conformacional

que libera la proteína represora del operador que como resultado permite que se produzca la transcripción. En el sistema Lac, se activa un operón lac en respuesta a la presencia de lactosa, o análogos sintéticos tales como isopropil-b-D-tiogalactósido. Desgraciadamente, el uso de tales sistemas está limitado por la química inestable de los ligandos, es decir tetraciclina y lactosa, por su toxicidad, por su presencia natural o por los niveles relativamente altos requeridos para la inducción o represión. Por motivos similares, está limitada la utilidad de tales sistemas en animales.

Las moléculas inmunosupresoras tales como FK506, rapamicina y ciclosporina A pueden unirse a inmunofilinas FKBP12, ciclofilina, etc. Usando esta información, se ha ideado una estrategia general para reunir dos proteínas cualesquiera colocando simplemente FK506 en cada una de las dos proteínas o colocando FK506 en una y 65 ciclosporina A en otra. Entonces puede usarse un homodímero sintético de FK506 (FK1012) o un compuesto que resulta de la fusión de FK506-ciclosporina (FKCsA) para inducir la dimerización de estas moléculas (Spencer et al.,

1993, Science 262:1019-24; Belshaw et al., 1996 Proc Natl Acad Sci U S A 93:4604-7) . Se usaron el dominio de unión a ADN de Gal4 fusionado a FKBP12 y el dominio activador de VP16 fusionado a ciclofilina y el compuesto FKCsA para mostrar heterodimerización y activación de un gen indicador bajo el control de un promotor que contiene sitios de unión a Gal4. Desgraciadamente, este sistema incluye inmunosupresores que pueden tener

efectos secundarios no deseados y por tanto, se limita su uso a diversas aplicaciones de cambio génico en mamíferos.

También se han empleado sistemas de activación de la transcripción de eucariotas superiores tales como sistemas de receptores de hormonas esteroideas. Los receptores de hormonas esteroideas son miembros de la superfamilia de receptores nucleares y se encuentran en células de vertebrados e invertebrados. Desgraciadamente, el uso de compuestos esteroideos que activan los receptores para la regulación de la expresión génica, particularmente en plantas y mamíferos, está limitado debido a su implicación en muchas otras rutas biológicas naturales en tales organismos. Con el fin de superar tales dificultades, se ha desarrollado un sistema alternativo usando receptores de ecdisona (EcR) de insectos El crecimiento, la muda y el desarrollo en los insectos están regulados por la hormona esteroidea ecdisona (hormona de la muda) y las hormonas juveniles (Dhadialla, et al., 1998, Annu. Rev. Entomol. 43: 545-569) . La diana molecular para ecdisona en insectos consiste en al menos el receptor de ecdisona (EcR) y la proteína ultraespiráculo (USP) . El EcR es un miembro de la superfamilia de receptores de esteroides nucleares que se caracteriza por dominios de unión a ADN y a ligandos distintivos y un dominio de activación (Koelle et al. 1991, Cell,

67: 59-77) . Los receptores EcR responden a varios compuestos esteroideos tales como ponasterona A y muristerona A. Recientemente, se han descrito compuestos no esteroideos con actividad agonista ecdiesteroide, incluyendo los insecticidas disponibles comercialmente tebufenozida y metoxifenozida que se comercializan en todo el mundo por Rohm and Haas Company (véase la solicitud de patente internacional nº PCT/EP96/00686 y la patente estadounidense 5.530.028) . Ambos análogos tienen perfiles de seguridad excepcionales para otros organismos.

El receptor de ecdisona (EcR) de insectos heterodimeriza con ultraespiráculo (USP) , el homólogo de insectos de RXR de mamíferos, y se une a elementos de respuesta del receptor de ecdisona y ecdiesteroides y activa la transcripción de genes de respuesta a ecdisona. Los complejos EcR/USP/ligando desempeñan importantes papeles durante el desarrollo y la reproducción de insectos. El EcR es un miembro de la superfamila de receptores de hormonas esteroideas y tiene cinco dominios modulares, dominios A/B (transactivación) , C (unión a ADN, heterodimerización) , D (bisagra, heterodimerización) , E (unión a ligando, heterodimerización y transactivación) y F (transactivación) . Algunos de estos dominios tales como A/B, C y E conservan su función cuando se fusionan a otras proteínas.

Los sistemas de expresión génica inducible regulados estrechamente, o “interruptores génicos”, son útiles en diversas aplicaciones, tales como terapia génica, producción a gran escala de proteínas en células, ensayos de selección de alto rendimiento basados en células, genómica funcional y regulación de caracteres en plantas y animales transgénicos.

La primera versión de un interruptor génico... [Seguir leyendo]

1. Compuesto seleccionado del grupo que consiste en:

a) N-terc-butil-N’- (3-hidroximetil-5-metil-2, 3-dihidro-benzo[1, 4]dioxin-6-carbonil) -hidrazida del ácido 3, 5-dimetilbenzoico, b) N-terc-butil-N’-[3- (terc-butil-dimetil-silaniloximetil) -5-metil-2, 3-dihidro-benzo[1, 4]dioxin-6-carbonil]-hidrazida del

ácido 3, 5-dimetil-benzoico, c) ácido 7-[N’-terc-butil-N’- (3, 5-dimetil-benzoil) -hidrazinocarbonil]-8-metil-2, 3-dihidro-benzo[1, 4]dioxin-2-carboxílico, d) éster metílico del ácido 7-[N’-terc-butil-N’- (3, 5-dimetil-benzoil) -hidrazinocarbonil]-8-metil-2, 3-dihidro

benzo[1, 4]dioxin-2-carboxílico,

e) N-terc-butil-N’- (3-semicarbazidometil-5-metil-2, 3-dihidro-benzo[1, 4]dioxin-6-carbonil) -hidrazida del ácido 3, 5dimetil-benzoico, f) éster 7-[N’-terc-butil-N’- (3, 5-dimetil-benzoil) -hidrazinocarbonil]-8-metil-2, 3-dihidro-benzo[1, 4]dioxin-2-ilmetílico del

ácido fenil-carbámico,

g) N’-[3- (2-amino-etil) -5-metil-2, 3-dihidro-benzo[1, 4]dioxin-6-carbonil]-N-terc-butil-hidrazida del ácido 3, 5-dimetilbenzoico, h) éster pentafluorofenílico del ácido 7-[N’-terc-butil-N’- (3, 5-dimetil-benzoil) -hidrazinocarbonil]-8-metil-2, 3-dihidro

benzo[1, 4]dioxin-2-carboxílico,

i) metilamida del ácido 7-[N’-terc-butil-N’- (3, 5-dimetil-benzoil) -hidrazinocarbonil]-8-metil-2, 3-dihidro-benzo[1, 4]dioxin2-carboxílico, j) N-terc-butil-N’- (3-formil-5-metil-2, 3-dihidro-benzo[1, 4]dioxin-6-carbonil) -hidrazida del ácido 3, 5-dimetil-benzoico, k) éster 7-[N’-terc-butil-N’- (3, 5-dimetil-benzoil) -hidrazinocarbonil]-8-metil-2, 3-dihidro-benzo[1, 4]dioxin-2-ilmetílico del

ácido tolueno-4-sulfónico,

l) N-terc-butil-N’-[3- (hidroxiimino-metil) -5-metil-2, 3-dihidro-benzo[1, 4]dioxin-6-carbonil]-hidrazida del ácido 3, 5-dimetilbenzoico, m) N-terc-butil-N’- (3-cianometil-5-metil-2, 3-dihidro-benzo[1, 4]dioxin-6-carbonil) -hidrazida del ácido 3, 5-dimetil

benzoico,

n) N-terc-butil-N’- (5-metil-3-metilsulfanilmetil-2, 3-dihidro-benzo[1, 4]dioxin-6-carbonil) -hidrazida del ácido 3, 5-dimetilbenzoico, o) N-terc-butil-N’- (3-metanosulfonilmetil-5-metil-2, 3-dihidro-benzo[1, 4]dioxin-6-carbonil) -hidrazida del ácido 3, 5

dimetil-benzoico, y p) N-terc-butil-N’- (3-fluorometil-5-metil-2, 3-dihidro-benzo[1, 4]dioxin-6-carbonil) -hidrazida del ácido 3, 5-dimetilbenzoico.

2. Composición farmacéutica que comprende un compuesto según la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.

3. Compuesto según la reivindicación 1 para su uso en la modulación de la expresión de un gen diana en una célula huésped no humana embrionaria, aislada, en el que se pone en contacto dicha célula huésped con dicho compuesto, y en el que dicha célula huésped incluye un primer casete de expresión génica que comprende un primer polinucleótido que codifica para un primer polipéptido que comprende:

(i) un dominio de transactivación;

(ii) un dominio de unión a ADN; y

(iii) un dominio de unión a ligando del receptor nuclear de grupo H; y un segundo casete de expresión génica que comprende:

(i) un elemento de respuesta que puede unirse a dicho dominio de unión a ADN;

(ii) un promotor que se activa mediante dicho dominio de transactivación; y

(iii) dicho gen diana.

4. Compuesto según la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de una enfermedad en un sujeto en el que dicho compuesto modula la expresión de uno o más genes exógenos que codifican para proteínas biológicamente activas.

5. Compuesto según la reivindicación 4 para su uso según la reivindicación 4, en el que dicha enfermedad es cáncer

o un trastorno genético.

6. Compuesto según la reivindicación 4 para su uso según la reivindicación 4, en el que dichos uno o más genes exógenos codifican para proteínas secretoras, enzimas, proteínas reguladoras, receptores de superficie celular, factores de coagulación sanguíneos, hormonas, citocinas, sustancias inhibidoras, toxina diftérica, toxina colérica, anticuerpos monoclonales o proteasas.

7. Compuesto según la reivindicación 6 para su uso según la reivindicación 6, en el que dichos uno o más genes exógenos codifican para citocinas.

8. Compuesto según la reivindicación 7 para su uso según la reivindicación 7, en el que dichas citocinas son linfocinas.

9. Compuesto según la reivindicación 7 para su uso según la reivindicación 7, en el que dichas citocinas son interferones, factor estimulante de colonias de macrófagos y granulocitos, factor estimulante de colonias 1, factor de necrosis tumoral o eritropoyetina.

10. Compuesto según la reivindicación 6 para su uso según la reivindicación 6, en el que dichas enzimas metabolizan un sustrato de una sustancia tóxica a una sustancia no tóxica o metabolizan un sustrato de una sustancia inactiva a una sustancia activa.

11. Compuesto según la reivindicación 6 para su uso según la reivindicación 6, en el que dichas hormonas son insulina, hormona paratiroidea, factor liberador de hormona luteinizante, inhibinas seminales alfa y beta u hormona de crecimiento humana.

12. Compuesto según la reivindicación 6 para su uso según la reivindicación 6, en el que dicha sustancia inhibidora es alfa1-antitripsina.

13. Compuesto según la reivindicación 1 para su uso en la regulación de la expresión génica endógena o heteróloga en un sujeto transgénico no animal o no humano que comprende poner en contacto dicho compuesto con un complejo de receptor de ecdisona dentro de las células de dicho sujeto, en el que dichas células contienen además una secuencia de unión a ADN para dicho complejo de receptor de ecdisona cuando está en combinación con dicho compuesto y en el que la formación de un complejo de complejo de receptor de ecdisona-compuesto-secuencia de unión a ADN induce la expresión de dicho gen.

14. Compuesto según la reivindicación 13 para su uso según la reivindicación 13, en el que dicho complejo de receptor de ecdisona es un complejo de receptor de ecdisona quimérico y dicho constructo de ADN comprende además un promotor.

15. Compuesto según la reivindicación 13 para su uso según la reivindicación 13, en el que dicho sujeto es una planta.

16. Compuesto según la reivindicación 1 para su uso en la modulación de la expresión de un gen en una célula huésped no humana embrionaria, aislada, que comprende las etapas de:

a) introducir en dicha célula huésped un sistema de modulación de la expresión génica que comprende:

i) un primer casete de expresión génica que puede expresarse en dicha célula huésped que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica para un primer polipéptido híbrido que comprende:

(a) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión va a modularse; y

(b) un dominio de unión a ligando del receptor de ecdisona;

ii) un segundo casete de expresión génica que puede expresarse en dicha célula huésped que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica para un segundo polipéptido híbrido que comprende:

(a) un dominio de transactivación; y

(b) un dominio de unión a ligando del receptor X retinoide quimérico; y

iii) un tercer casete de expresión génica que puede expresarse en dicha célula huésped que comprende una secuencia de polinucleótido que comprende:

(a) un elemento de respuesta reconocido por dicho dominio de unión a ADN de dicho primer polipéptido híbrido;

(b) un promotor que se activa mediante dicho dominio de transactivación de dicho segundo polipéptido híbrido; y

(c) un gen cuya expresión va a modularse; y b) introducir en dicha célula huésped dicho compuesto.

17. Compuesto según la reivindicación 1 para su uso en la producción de un polipéptido en una célula huésped no humana embrionaria, aislada, que comprende las etapas de: a) seleccionar una célula que es sustancialmente insensible a la exposición a dicho compuesto; b) introducir en dicha célula: 1) un constructo de ADN que comprende: i) un gen exógeno que codifica para el polipéptido; y ii) un elemento de respuesta; en el que dicho gen está bajo el control de dicho elemento de respuesta; y 2) un constructo de ADN que codifica para un complejo de receptor de ecdisona que comprende: i) un dominio de unión a ADN; ii) un dominio de unión a ligando del receptor de ecdisona; y

iii) un dominio de transactivación; y c) exponer dicha célula a dicho compuesto.

18. Uso de un compuesto según la reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para:

1) modular la expresión de un gen diana en una célula huésped no humana embrionaria, en el que la célula huésped incluye un primer casete de expresión génica que comprende un primer polinucleótido que codifica para un primer polipéptido que comprende:

(i) un dominio de transactivación;

(ii) un dominio de unión a ADN; y

(iii) un dominio de unión a ligando del receptor nuclear de grupo H; y un segundo casete de expresión génica que comprende:

(i) un elemento de respuesta que puede unirse a dicho dominio de unión a ADN;

(ii) un promotor que se activa mediante dicho dominio de transactivación; y

(iii) dicho gen diana;

2) modular la expresión de uno o más genes exógenos en un sujeto;

3) regular la expresión génica endógena o heteróloga en un sujeto transgénico no humano que comprende poner en contacto dicho compuesto con un complejo de receptor de ecdisona dentro de las células de dicho sujeto, en el que dichas células contienen además una secuencia de unión a ADN para dicho complejo de receptor de ecdisona cuando está en combinación con dicho compuesto y en el que la formación de un complejo de complejo de receptor de ecdisona-compuesto-secuencia de unión a ADN induce la expresión de dicho gen; 4) modular la expresión de un gen en una célula huésped que comprende las etapas de:

a) introducir en dicha célula huésped un sistema de modulación de la expresión génica que comprende: i) un primer casete de expresión génica que puede expresarse en dicha célula huésped que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica para un primer polipéptido híbrido que comprende:

(a) un dominio de unión a ADN que reconoce un elemento de respuesta asociado con un gen cuya expresión va a modularse; y

(b) un dominio de unión a ligando del receptor de ecdisona;

ii) un segundo casete de expresión génica que puede expresarse en dicha célula huésped que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica para un segundo polipéptido híbrido que comprende:

(a) un dominio de transactivación; y

(b) un dominio de unión a ligando del receptor X retinoide quimérico; y

iii) un tercer casete de expresión génica que puede expresarse en dicha célula huésped que comprende una secuencia de polinucleótido que comprende:

(a) un elemento de respuesta reconocido por dicho dominio de unión a ADN de dicho primer polipéptido híbrido;

(b) un promotor que se activa mediante dicho dominio de transactivación de dicho segundo polipéptido híbrido; y

(c) un gen cuya expresión va a modularse; y b) introducir en dicha célula huésped dicho compuesto; o 5) producir un polipéptido que comprende las etapas de: a) seleccionar una célula que es sustancialmente insensible a la exposición a dicho compuesto; b) introducir en dicha célula: 1) un constructo de ADN que comprende: i) un gen exógeno que codifica para el polipéptido; y ii) un elemento de respuesta; en el que dicho gen está bajo el control de dicho elemento de respuesta; y 2) un constructo de ADN que codifica para un complejo de receptor de ecdisona que comprende: i) un dominio de unión a ADN; ii) un dominio de unión a ligando del receptor de ecdisona; y iii) un dominio de transactivación; y c) exponer dicha célula a dicho compuesto.