Células dendríticas modificadas por ingeniería y usos para el tratamiento del cáncer.

Uso de células dendríticas modificadas por ingeniería in vitro que comprenden un vector para expresar de forma condicional una proteína que tiene la función de interleuquina-12 (IL-12) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un tumor en un mamífero,

Comprendiendo dicho vector un polinucleótido que codifica un conmutador génico,

comprendiendo dicho conmutador génico

(1) al menos una secuencia de factor de transcripción, en donde dicha al menos una secuencia de factor de transcripción codifica un factor de transcripción dependiente de ligando, unido de forma funcional a un promotor, y

(2) un polinucleótido que codifica una proteína que tiene la función de IL-12 unido a un promotor que es activado por dicho factor de transcripción dependiente de ligando,

en que dicho polinucleótido que codifica dicha proteína que tiene la función de IL-12 codifica una proteína que es al menos un 85 % idéntica a IL-12 humana de tipo silvestre, y

en el que dicho ligando se tiene que administrar a las de 24 horas o menos después de la administración de dichas células y diariamente durante un periodo de 5 a 28 días.

Células dendríticas modificadas por ingeniería y usos para el tratamiento del cáncer Antecedentes de la invención Campo de la invención

Esta invención se refiere al campo de la terapia génica para el tratamiento del cáncer. En una realización, la invención se refiere a la ingeniería de células dendríticas para expresar condicionalmente interleuquina-12 (IL-12) y el uso de las células para terapéutica. En otra realización, la invención se refiere a la ingeniería de células dendríticas para expresar condicionalmente interleuquina-12 (IL-12) y/o interferón alfa (IFN-alfa) y el uso de las células para terapéutica.

Antecedentes

Diversas patentes, solicitudes de patente y publicaciones se citan en este documento. Sin embargo, la mención de cualquier referencia en este documento no debe interpretarse como una admisión de que dicha referencia está disponible como "técnica previa" a la presente solicitud.

La interleuquina-12 (IL-12) es un miembro de la familia de citoquinas de tipo I implicada en la contribución a varios procesos biológicos incluyendo, aunque sin limitación, la respuesta inmune protectora y la supresión de la tumorigénesis (Abdi et al., 26; Adorini, 1999; Adorini, 21; Adorini et al., 22; Adorini et al., 1996; Akhtar et al., 24; Akiyama et al., 2; Al-Mohanna et al., 22; Aliberti et al., 1996; Allavena et al., 1994; Alii y Khar, 24; Alzona et al., 1996; Amemiya et al., 26; Araujo et al., 21; Arulanandam et al., 1999; Athie et al., 2; Athie- Morales et al., 24; Bertagnolli et al., 1992; Bhardwaj et al., 1996; Biedermann et al., 26; Brunda y Gately, 1994; Buchanan et al., 1995; Romani et al., 1997; Rothe et al., 1996; Satoskaret al., 2; Schopf et al., 1999; Thomas et al., 2; Tsung et al., 1997; Wolf et al., 1994; Yuminamochi et al., 27). Un creciente conjunto de evidencias sugiere que la IL-12 puede ser una diana prometedora para el control de enfermedades humanas (por ejemplo, cáncer).

A pesar de que la IL-12 sigue siendo prometedora como agente terapéutico contra el cáncer basado en su potente actividad de soporte sobre células NK anti-tumorales Tlpo-1, células T CD4+ y células T CD8+ (Trinchieri, 23), la toxicidad informada de la IL-12 humana recombinante (rhlL-12) en pacientes (Atkins et al., 1997), junto con fuentes limitadas de rhlL-12 de grado GMP para aplicación clínica, ha impedido enfoques terapéuticos satisfactorios basados en IL-12. Por tanto, parece razonable que enfoques de terapia génica puedan representar opciones de tratamiento más seguras, más sostenibles. De hecho, los ensayos clínicos en fase I que aplican suministro intra- o peri-tumoral de ADNc de IL-12 recombinante basado en virus (Sangro et al., 24; Triozzi et al., 25) o plásmidos (Heinzerling et al., 25), o fibroblastos autólogos modificados con genes de IL-12 (Kang et al., 21) se han encontrado seguros y bien tolerados.

Sin embargo, las respuestas clínicas objetivas en pacientes con melanoma o una diversa gama de carcinomas que reciben estas terapias génicas han sido raras, variable, transitorias y en gran parte centradas en el sitio de tratamiento (Heinzerling et al., 25; Kang et al., 21; Sangro et al., 24; Triozzi et al., 25). En casos en los que la resolución de la enfermedad fue parcial o completa, se han observado frecuencias aumentadas de linfocitos infiltrantes de tumor (Heinzerling et al., 25; Sangro et al., 24) y niveles elevados de células T CD8+ específicas de tumor en circulación (Heinzerling et al., 25), en consonancia con el cebado cruzado mejorado de células T específicas de antígeno en estos pacientes.

Además, surgieron varias preocupaciones residuales, por ejemplo, toxicidades imprevistas asociadas con la terapia génica con IL-12 basada en DC y limitaciones potenciales dependientes de IL-12 en la migración de DC.IL12 terapéutico después de administración intratumoral. Además, hay preocupaciones adicionales respecto a la cronología de producción de IL-12 en DC transducidas muy importante para la eficacia terapéutica (Murphy et al.,

25)

Como el cebado cruzado de células T específicas se logra mejor mediante células dendríticas (DC) que sirven como fuente natural pero regulada de IL-12 (Berard et al., 2), los últimos informes de la eficacia preclínica superior de terapia génica con IL-12 basada en DC han sido de gran interés (Satoh et al., 22; Tatsumi et al., 23; Yamanaka et al., 22). Por ejemplo, se demostró que la inyección intratumoral (i.t.) de DC modificadas por ingeniería para producir IL-12p7 (mediante infección por adenovirus recombinante) provoca el cebado cruzado mejorado drásticamente de un repertorio ampliamente reactivo de células T CD8+ específico de tumor en concierto con el rechazo del tumor en modelos murinos (Tatsumi et al., 23). Dado el uso previo de un adenovirus recombinante que codifica mlL-12 bajo un promotor basado en CMV (rAd.clLI2, (Tatsumi et al., 23)), la producción por DC modificadas por ingeniería de IL-12 fue constitutiva, por tanto, el impacto inmunológico de esta citoquina temprana dentro de la lesión tumoral y más tarde dentro de ganglios linfáticos de drenaje tumoral no se pudo resolver con respecto a los resultados terapéuticos. Se conocen en la técnica sistemas para la expresión génica condicional.

Karzenowski et al. (26). (RheoSwitch® Therapeutic System-lnducible Recombinant AAV Vectors for Tightly Regulated Transgene Expression. Molecular Therapy, volumen 13, suplemento 1, página S 194.) describe el uso de vectores de AAV recombinante (wAAV) para el suministro del sistema terapéutico RheoSwitch® (RTS). Se indica que este sistema permite el control regulador de expresión génica terapéutica a largo plazo in vivo. La tecnología de expresión génica RTS permite controlar la cronología y dosis precisas de la proteína terapéutica a través de la administración sistémica de un fármaco activado farmacológicamente inerte altamente específico.

Vilaboa et al. (26). (Regulatable Gene Expression Systems for Gene Therapy. Current Gene Therapy, Volumen 6, páginas 421-438.) revisa sistemas de expresión génica regulables para terapia génica. Indica que la regulación temporal de transgenes puede conseguirse mediante conmutadores génicos que se activan mediante un inductor de molécula pequeña apropiado y que la regulación tanto espacial como temporal de la actividad del transgén puede controlarse mediante una nueva generación de conmutadores génicos, que combinan un promotor de gen de proteína de choque térmico y un conmutador génico sensible a molécula pequeña.

Lessard et al., (27). (Characterisation of the RSLI-Dependent Conditional Expression System in LNCaP prostate cáncer cells and development of a single vector format Prostate, volumen 67, páginas 88-819), indica que el sistema RheoSwitch es muy adecuado para la expresión génica condicional en células de cáncer de próstata.

Vujanovic et al., (26). (IL-12p7 and IL-18 gene-modified dendritic cells loaded with tumor antigen-derived peptides or recombinant protein effectively stimulate specific Type-1 CD4(+) T-cell responses from normal donors and melanoma patients in vitro. Cáncer Gene Therapy, volumen 13, páginas 798-85) describe células dendríticas humanas modificadas por ingeniería genética que secretan altos niveles de IL-12, mediante infección adenoviral recombinante, para el tratamiento del cáncer.

Mazzolini et al. (25). (Intratumoral Injection of Dendritic Cells Engineered to Secrete lnterleukin-12 by Recombinant Adenovirus in Patients with Metastatic Gastrointestinal Carcinomas. Molecular Therapy. Volumen 11, páginas 437- 438), describe la inyección intratumoral de células dendríticas modificadas por ingeniería para secretar interleuquina- 12 mediante infección adenoviral recombinante para el tratamiento de pacientes con carcinomas gastrointestinales.

Katakam et al. (26). (Retroviral Delivery of the RheoSwitch® Therapeutic System for Precisely Regulated Expression of BMP-2 for Bone Regeneration. Molecular Therapy. Volumen 13, página 5422.) describe el suministro retroviral del sistema RheoSwitch para la expresión regulada de forma precisa de BMP-2 para regeneración ósea.

El documento US25/191659 describe circuitos moleculares que proporciona expresión sostenida de un gen de interés después de una única aplicación de estrés. Generalmente, los circuitos moleculares de la invención comprenden (a) una primera molécula de ácido nucleico que comprende un gen que codifica un factor de transcripción y un primer promotor o un promotor de combinación que se puede activar por estrés y por el factor de transcripción, donde el primer promotor o el promotor de combinación y el gen del factor de transcripción están unidos de forma funcional, y (b) una segunda molécula de ácido... [Seguir leyendo]

1. Uso de células dendríticas modificadas por ingeniería in vitro que comprenden un vector para expresar de forma condicional una proteína que tiene la función de interleuquina-12 (IL-12) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un tumor en un mamífero,

Comprendiendo dicho vector un polinucleótido que codifica un conmutador génico, comprendiendo dicho conmutador génico

(1) al menos una secuencia de factor de transcripción, en donde dicha al menos una secuencia de factor de transcripción codifica un factor de transcripción dependiente de ligando, unido de forma funcional a un promotor,

y

(2) un polinucleótido que codifica una proteína que tiene la función de IL-12 unido a un promotor que es activado por dicho factor de transcripción dependiente de ligando,

en que dicho polinucleótido que codifica dicha proteína que tiene la función de IL-12 codifica una proteína que es al menos un 85 % idéntica a IL-12 humana de tipo silvestre, y

en el que dicho ligando se tiene que administrar a las de 24 horas o menos después de la administración de dichas células y diariamente durante un periodo de 5 a 28 días.

2. El uso de la reivindicación 1, en el que dicho ligando se administra a las de 24 horas o menos después de la administración de dichas células y diariamente durante 14 días.

3. El uso de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2, en el que dicho vector es un vector adenoviral.

4. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho conmutador génico es un conmutador génico basado en receptor de ecdisona (EcR).

5. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho polinucleótido que codifica un conmutador génico comprende una primera secuencia de factor de transcripción y una segunda secuencia de factor de transcripción bajo el control de un promotor, en donde las proteínas codificadas por dicha primera secuencia de factor de transcripción y dicha segunda secuencia de factor de transcripción interaccionan para formar un complejo proteico que funciona como factor de transcripción dependiente de ligando.

6. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho primer factor de transcripción y dicho segundo factor de transcripción están conectados por un sitio interno de entrada al ribosoma.

7. El uso de una de las reivindicaciones 4 a 6, en el que la primera secuencia de factor de transcripción comprende un ácido nucleico que codifica un dominio de transactivación VP-16 y una proteína de receptor X retinoico (RXR).

8. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 7, en el que dicha segunda secuencia de factor de transcripción comprende un ácido nucleico que codifica un dominio de unión a ADN GAL-4 y proteína de receptor de ecdisona (EcR).

9. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho vector comprende adicionalmente un polinucleótido que codifica una proteína que tiene la función de IFN-alfa unido a un promotor que es activado por dicho factor de transcripción dependiente de ligando.

1. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho polinucleótido que codifica una proteína que tiene la función de IL-12 codifica IL-12 humana.

11. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1, en el que dichas células modificadas por ingeniería in vitro son adecuadas para administración intratumoral, intraperitoneal o subcutánea.

12. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicho tumor es melanoma.

13. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dicho ligando se selecciona entre el grupo que consiste en N-(1-etil-2,2-dimetilpropil)-N'-(2-metil-3-metoxi-benzoil)-hidrazida del ácido 3,5-dimetil-benzoico, N-(1- terc-butil-butil)-N'-(2-etil-3-metoxi-benzoil)-hidrazida del ácido (R)-3,5-dimetil-benzoico y N-(1-terc-butil-butil)-N'-(2- etil-3-metoxi-benzoil)-hidrazida del ácido 3,5-dimetil-benzoico.

14. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicha proteína que es al menos un 85 % idéntica a IL-12 humana de tipo silvestre es al menos un 9 % idéntica a IL-12 humana de tipo silvestre.

15. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicha proteína que es al menos un 85 % idéntica a IL-12 humana de tipo silvestre es al menos un 95 % idéntica a IL-12 humana de tipo silvestre.

16. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dicha proteína que es al menos un 85 % idéntica a IL-12 humana de tipo silvestre es al menos un 99 % idéntica a IL-12 humana de tipo silvestre.