Sacarificación mejorada de celulosa por clonación y amplificación del gen de beta-glucosidasa de Trichoderma reesei.

SE PONE A DISPOSICION UN PROCESO PARA LA EXPRESION EXTRACELULAR BETA-GLUCOSIDASA EN UN HONGO FILAMENTOSO MEDIANTE LA EXPRESION DE UNA SECUENCIA DNA FUNGOSA CODIFICANDO EL BETA-GLUCOSIDASA DE FORMA INCREMENTADA,

ELIMINADA O ALTERADA EN UN MICROORGANISMO ANFITRION RECOMBINANTE. SE DAN A CONOCER TAMBIEN LAS COMPOSICIONES FUNGOSAS DE CELULOSA RECOMBINANTE CONTENIENDO LAS EXPRESIONES DE BETA-GLUCOSIDASA INCREMENTADAS, ELIMINADAS O ALTERADAS.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US1991/009285.

Solicitante: DANISCO US INC.

Inventor/es: FOWLER, TIMOTHY, BARNETT, CHRISTOPHER, C., SHOEMAKER, SHARON.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A23L1/22 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A23 ALIMENTOS O PRODUCTOS ALIMENTICIOS; SU TRATAMIENTO, NO CUBIERTO POR OTRAS CLASES.A23L ALIMENTOS, PRODUCTOS ALIMENTICIOS O BEBIDAS NO ALCOHOLICAS NO CUBIERTOS POR LAS SUBCLASES A21D O A23B - A23J; SU PREPARACION O TRATAMIENTO, p. ej. COCCION, MODIFICACION DE LAS CUALIDADES NUTRICIONALES, TRATAMIENTO FISICO (conformación o tratamiento, no enteramente cubierto por la presente subclase, A23P ); CONSERVACION DE ALIMENTOS O DE PRODUCTOS ALIMENTICIOS, EN GENERAL (conservación de la harina o las masas panificables A21D). › A23L 1/00 Alimentos o productos alimenticios; Su preparación o tratamiento (su conservación en general A23L 3/00). › Especias; Agentes aromatizantes o condimentos; Edulcorantes artificiales; Sales de mesa; Sustitutos dietéticos de la sal.
  • C11D3/386 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C11 ACEITES, GRASAS, MATERIAS GRASAS O CERAS ANIMALES O VEGETALES; SUS ACIDOS GRASOS; DETERGENTES; VELAS.C11D COMPOSICIONES DETERGENTES; UTILIZACION DE UNA SOLA SUSTANCIA COMO DETERGENTE; JABON O SU FABRICACION; JABONES DE RESINA; RECUPERACION DE LA GLICERINA.C11D 3/00 Otros compuestos que entran en las composiciones detergentes cubiertas por C11D 1/00. › Preparaciones que contienen enzimas.
  • C12G1/00 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12G VINO; OTRAS BEBIDAS ALCOHOLICAS; SU PREPARACION (cerveza C12C). › Preparación de vino o vino espumoso.
  • C12G1/02 C12G […] › C12G 1/00 Preparación de vino o vino espumoso. › Preparación de mosto a partir de las uvas; Tratamiento o fermentación del mosto.
  • C12N1/15 C12 […] › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12N15/00 C12N […] › Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K).
  • C12N15/09 C12N […] › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Tecnología del ADN recombinante.
  • C12N15/55 C12N 15/00 […] › Hidrolasas (3).
  • C12N15/56 C12N 15/00 […] › que actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2), p. ej. amilasa, galactosidasa, lisozima.
  • C12N15/80 C12N 15/00 […] › para hongos.
  • C12N9/24 C12N […] › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre compuestos glicosílicos (3.2).
  • C12N9/26 C12N 9/00 […] › actúan sobre enlaces alfa-glucosídicos-1, 4, p. ej. hialuronidasa, invertasa, amilasa.
  • C12N9/42 C12N 9/00 […] › actúan sobre los enlaces beta-glucosídicos-1,4, p. ej. celulasa.
  • C12P19/00 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58).
  • C12P19/14 C12P […] › C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › preparados por acción de una carbohidrasa, p. ej. por acción de la alfa-amilasa.
  • C12R1/885 C12 […] › C12R SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C - C12Q, RELATIVO A LOS MICROORGANISMOS.C12R 1/00 Microorganismos. › Trichoderma.

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Fragmento de la descripción:

Sacarificación mejorada de celulosa por clonación y amplificación del gen de beta-glucosidasa de trichoderma reesei.

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a preparaciones y composiciones de celulasa que presentan una capacidad celulolítica aumentada o reducida. La invención se refiere además a una secuencia de nucleótidos del gen bgl1 que codifica la b -glucosidasa extracelular de un hongo filamentoso, a un vector plasmídico que contiene el gen que codifica la b -glucosidasa extracelular y a cepas transformadas con un mayor número de copias del gen de la b -glucosidasa (bgl1) introducido en el genoma. Más concretamente, la presente invención se refiere a cepas de Trichoderma reesei que presentan niveles de expresión aumentados del gen bgl1, lo que da como resultado niveles proteicos aumentados de la b -glucosidasa extracelular que se pueden usar, junto con otras composiciones, para producir un producto de celulasa con una mayor capacidad celulolítica.

2. Estado de la técnica

Las celulasas se conocen en la técnica como las enzimas que hidrolizan celulosa (enlaces b -1,4-glucano), originando de este modo la formación de glucosa, celobiosa, celooligosacáridos y similares. Según señalaron Wood et al., "Methods in Enzymology", 160, 25, páginas 234 y siguientes (1988) y en otros lugares, la celulasa producida por determinados microorganismos está compuesta por varias clases de enzimas diferentes que incluyen las que se identificaron como exocelobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) ("CBH"), endoglucanasas (EC 3.2.1.4) ("EG"), b -glucosidasas (EC 3.2.1.21) ("BG"). Además, las clasificaciones fúngicas de CBH, EG y BG se pueden ampliar adicionalmente para incluir múltiples componentes en cada clasificación. Por ejemplo, se han aislado múltiples CBHs y EGs de una diversidad de fuentes bacterianas y fúngicas, incluido Trichoderma reesei que contiene 2 CBHs, es decir CBH I y CBH II, y al menos 3 EGs, es decir los componentes EG I, EG II y EG III.

El sistema de celulasa completo, que comprende componentes de cada una de las clasificaciones de CBH, EG y BG, es necesario para convertir eficazmente las formas cristalinas de la celulosa en glucosa. Los componentes aislados son bastante menos eficaces, si es que lo son, en la hidrólisis de la celulosa cristalina. Además, se observa una relación sinérgica entre los componentes de la celulasa, especialmente si son de diferentes clasificaciones. Esto quiere decir que la efectividad del sistema de celulasa completo es significativamente mayor que la suma de las contribuciones de los componentes individuales de la misma clasificación. A este respecto, se conoce en la técnica que los componentes EG y los componentes CBH interactúan sinérgicamente para degradar la celulosa con mayor eficacia. Véase, por ejemplo, Wood, Biochem. Soc. Trans., 13, páginas 407-410 (1985).

La especificidad por el sustrato y el modo de acción de los diferentes componentes de la celulasa varían según la clasificación, lo que puede explicar la sinergia entre los componentes combinados. Por ejemplo, el modo de acción actualmente aceptado de la celulasa es que los componentes endoglucanasa hidrolizan los enlaces b -1,4-glucosídicos internos, especialmente en regiones de baja cristalinidad de la celulosa, y los componentes exocelobiohidrolasa hidrolizan la celobiosa por el extremo no reductor de la celulosa. La acción de los componentes endoglucanasa facilita enormemente la acción de las exocelobiohidrolasas creando nuevos extremos de cadena que son reconocidos por los componentes exocelobiohidrolasa.

Las b -glucosidasas son componentes esenciales del sistema de celulasa y son importantes para la degradación enzimática completa de la celulosa en glucosa. Las enzimas b -glucosidasa pueden catalizar la hidrólisis de alquil- y/o aril-b -D-glucósidos, tales como metil-b -D-glucósido y p-nitrofenil-glucósido, así como de glucósidos que contienen sólo residuos carbohidrato, tales como la celobiosa. La catálisis de la celobiosa mediante la b -glucosidasa es importante porque produce glucosa para el microorganismo y porque la acumulación de celobiosa inhibe las celobiohidrolasas y las endoglucanasas, reduciendo así la velocidad de hidrólisis de celulosa a glucosa.

Puesto que las b -glucosidasas pueden catalizar la hidrólisis de numerosos sustratos diferentes, es posible usar esta enzima en una variedad de aplicaciones diferentes. Por ejemplo, algunas b -glucosidasas se pueden usar para liberar aroma de fruta mediante la catálisis de diversos glucósidos presentes en ella. De forma similar, algunas b -glucosidasas pueden hidrolizar el monoterpenil-b -glucósido de uva que, después de la hidrólisis, representa una importante fuente potencial de aroma para vino, según describió Günata et al., "Hydrolysis of Grape Monoterpenyl b -Glucosides by Various b -Glucosidases", J. Agric. Food Chem., vol. 38, páginas 1232-1236 (1990).

Además, las celulasas se pueden usar junto con levaduras para degradar biomasa a etanol, donde la celulasa degrada la celobiosa a glucosa la cual puede ser fermentada adicionalmente por las levaduras para producir etanol. Esta producción de etanol a partir de fuentes de celulosa fácilmente disponibles puede proporcionar una fuente estable y renovable de combustible. El uso de etanol como combustible presenta muchas ventajas en comparación con los productos combustibles de petróleo, tales como la reducción de la contaminación del aire en las ciudades, de la niebla contaminante y de los niveles de ozono, mejorando así el medio ambiente. Además, el etanol como fuente de combustible reduciría la dependencia de la importación de petróleo del extranjero y los suministros petroquímicos.

Sin embargo, el paso limitante más importante en la velocidad de la producción de etanol a partir de biomasa es la cantidad insuficiente de b -glucosidasa presente en el sistema para convertir eficazmente la celobiosa en glucosa. Por lo tanto, sería útil para la producción de etanol una composición de celulasa que contenga una mayor cantidad de b -glucosidasa.

Por el contrario, en algunos casos es deseable producir una composición de celulasa que sea deficiente en b -glucosidasa y que, preferentemente, carezca de ella. Tales composiciones resultarían ventajosas en la producción de celobiosa y otros celooligosacáridos.

Las b -glucosidasas están presentes en una variedad de organismos procarióticos, así como en organismos eucarióticos. Se ha clonado el gen que codifica la b -glucosidasa de varios organismos procarióticos, y el gen es capaz de dirigir la síntesis de cantidades detectables de proteína en E. coli sin la necesidad de extensa ingeniería genética, aunque en algunos casos es necesario acoplarlo con un promotor proporcionado por el vector. Sin embargo, tales organismos no producen las b -glucosidasas en cantidades comercialmente factibles.

Además, estos genes procarióticos a menudo no se pueden expresar y detectar después de la transformación del huésped eucariótico. Así, con el fin de usar cepas fúngicas, se tendría que clonar genes fúngicos usando los métodos descritos en la presente memoria o mediante la detección con el gen bgl1 de T. reesei por hibridación de ácidos nucleicos.

La contribución y bioquímica del componente b -glucosidasa en la hidrólisis de celulosa se complica por la aparente multiplicidad de formas enzimáticas asociada con T. reesei y otras fuentes fúngicas (Enari et al., "Purification of Trichoderma reesei and Aspergillus niger b -glucosidase", J. Appl. Biochem., vol. 3, páginas 157-163 (1981); Umile et al., "A constitutive, plasma membrane bound b -glucosidase in Trichoderma reesei", FEMS Microbiology Letters, vol. 34, páginas 291-295 (1986); Jackson et al., "Purification and partial characterization of an extracellular b... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para modificar la expresión de la b -glucosidasa extracelular en un hongo filamentoso, que comprende transformar dicho hongo con un vector de expresión que contiene una secuencia de ADN fúngico que:

es capaz de potenciar la expresión de la b -glucosidasa extracelular a través de la presencia de al menos una copia adicional de un gen de b -glucosidasa fúngico; o
codifica una b -glucosidasa extracelular alterada, es decir, una enzima con una secuencia de aminoácidos que ha sido alterada con respecto a la codificada por el gen bgl1 procedente de Trichoderma reesei por manipulación de dicha secuencia de ADN de bgl1.

2. Un procedimiento para potenciar la expresión de la b -glucosidasa extracelular de acuerdo con la reivindicación 1(a), en el que dicho vector de expresión comprende toda la secuencia codificante de un gen de b -glucosidasa fúngico y las secuencias necesarias para la transcripción y traducción del gen de la b -glucosidasa.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho hongo filamentoso se selecciona de los géneros Trichoderma, Aspergillus, Neurospora, Humicola y Penicillium.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho hongo filamentoso es Trichoderma reesei, Trichoderma viridae, Trichoderma koningii, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus wentii, Aspergillus oryzae, Aspergillus phoenicis, Neurospora crassa, Humicola grisea, Penicillium pinophilum o Penicillium oxalicum.

5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho gen de la b -glucosidasa es un gen bgl1 procedente de Trichoderma reesei.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho gen bgl1 comprende los aminoácidos codificados por la secuencia de nucleótidos de 311 a 2679 de la Figura 1.

7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente la etapa de aislamiento de los transformantes que presentan una expresión modificada de la b -glucosidasa.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende adicionalmente las etapas de:

cultivar dichos transformantes en condiciones que permiten el crecimiento de dichos transformantes; y
aislar una composición de celulasa fúngica recombinante producida por dichos transformantes.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicha composición de celulasa fúngica recombinante se aísla mediante:

centrifugación de dicho medio de cultivo que contiene dichos transformantes para formar un sobrenadante y un sedimento; y
filtración de dicho sobrenadante para obtener una composición de celulasa fúngica recombinante.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que se añade un agente antimicrobiano a dicha composición de celulasa fúngica recombinante después de la filtración.

11. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que comprende adicionalmente la etapa de purificación de un producto de expresión de dicha composición de celulasa fúngica recombinante aislada.

12. Una composición de celulasa fúngica procedente de un hongo filamentoso, que comprende una b -glucosidasa extracelular alterada recombinante producida mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 únicamente en la medida en que dependan de la reivindicación 1(b).

13. Un método para producir glucosa a partir de materiales celulósicos o heteroglicanos que comprende el uso de una composición de celulasa fúngica recombinante que presenta una actividad b -glucosidasa aumentada, producida mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 únicamente en la medida en que dependan de la reivindicación 1(a).

14. Un método para degradar los materiales celulósicos presentes en desechos, biomasa o lodo que comprende el uso de una composición de celulasa fúngica recombinante que presenta una actividad b -glucosidasa aumentada, producida mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 únicamente en la medida en que dependan de la reivindicación 1(a).

15. Un procedimiento para degradar celulosa a glucosa, que comprende el uso de una composición de celulasa fúngica recombinante que presenta una actividad b -glucosidasa aumentada, producida mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 únicamente en la medida en que dependan de la reivindicación 1(a).

16. Un procedimiento para usar la composición de celulasa fúngica recombinante que presenta una actividad b -glucosidasa aumentada, producida mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 únicamente en la medida en que dependan de la reivindicación 1(a), o la b -glucosidasa purificada producida mediante el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12 en aditivos alimentarios para potenciar el sabor y el aroma.

17. Una composición de detergente que comprende una cantidad limpiadora eficaz de un tensioactivo y al menos 0,0001 por ciento en peso de una composición de celulasa fúngica recombinante que presenta una actividad b -glucosidasa aumentada, producida mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 únicamente en la medida en que dependan de la reivindicación 1(a).

18. Un método para usar la composición de celulasa que presenta una actividad b -glucosidasa aumentada, producida mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 únicamente en la medida en que dependan de la reivindicación 1(a), en el que dicho método comprende la adición de dicha composición de celulasa fúngica recombinante a levadura y biomasa para formar una mezcla y el cultivo de dicha mezcla a una temperatura suficiente y durante un periodo de tiempo suficiente para producir etanol.

19. Transformantes producidos mediante el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7 únicamente en la medida en que dependa de la reivindicación 1(a).

20. Un método para usar los transformantes que presentan una actividad b -glucosidasa extracelular aumentada de la reivindicación 19 únicamente en la medida en que dependa de la reivindicación 1(a), comprendiendo dicho método la adición de dichos transformantes a levadura y biomasa para formar una mezcla y el cultivo de dicha mezcla a una temperatura suficiente y durante un periodo de tiempo suficiente para producir etanol.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 18 o la reivindicación 20, en el que dicha levadura es B. clausenii, S. cerevisiae, Cellulolyticus acidothermophilium, C. brassicae, C. lustinaniae, S. uvarum o Schizosaccharomyces pombe.

22. Una secuencia de nucleótidos de un gen bgl1 cuya secuencia completa o parcial está o no marcada para el uso como sonda en la que el gen bgl1 tiene la secuencia de nucleótidos de la Figura 1.

23. Un método para usar una sonda que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 22, para identificar un gen de la b -glucosidasa de un hongo filamentoso.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 23, en el que dicha sonda proviene de Trichoderma reesei.

25. El método de acuerdo con la reivindicación 23 o la reivindicación 24, en el que se pueden usar una o más sondas para identificar dicho gen de la b -glucosidasa de un hongo filamentoso.


 

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