Sacarificación mejorada de celulosa por clonación y amplificación del gen de beta-glucosidasa de Trichoderma reesei.

SE PONE A DISPOSICION UN PROCESO PARA LA EXPRESION EXTRACELULAR BETA-GLUCOSIDASA EN UN HONGO FILAMENTOSO MEDIANTE LA EXPRESION DE UNA SECUENCIA DNA FUNGOSA CODIFICANDO EL BETA-GLUCOSIDASA DE FORMA INCREMENTADA,

ELIMINADA O ALTERADA EN UN MICROORGANISMO ANFITRION RECOMBINANTE. SE DAN A CONOCER TAMBIEN LAS COMPOSICIONES FUNGOSAS DE CELULOSA RECOMBINANTE CONTENIENDO LAS EXPRESIONES DE BETA-GLUCOSIDASA INCREMENTADAS, ELIMINADAS O ALTERADAS.

Sacarificación mejorada de celulosa por clonación y amplificación del gen de beta-glucosidasa de trichoderma reesei.

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a preparaciones y composiciones de celulasa que presentan una capacidad celulolítica aumentada o reducida. La invención se refiere además a una secuencia de nucleótidos del gen bgl1 que codifica la b -glucosidasa extracelular de un hongo filamentoso, a un vector plasmídico que contiene el gen que codifica la b -glucosidasa extracelular y a cepas transformadas con un mayor número de copias del gen de la b -glucosidasa (bgl1) introducido en el genoma. Más concretamente, la presente invención se refiere a cepas de Trichoderma reesei que presentan niveles de expresión aumentados del gen bgl1, lo que da como resultado niveles proteicos aumentados de la b -glucosidasa extracelular que se pueden usar, junto con otras composiciones, para producir un producto de celulasa con una mayor capacidad celulolítica.

2. Estado de la técnica

Las celulasas se conocen en la técnica como las enzimas que hidrolizan celulosa (enlaces b -1,4-glucano), originando de este modo la formación de glucosa, celobiosa, celooligosacáridos y similares. Según señalaron Wood et al., "Methods in Enzymology", 160, 25, páginas 234 y siguientes (1988) y en otros lugares, la celulasa producida por determinados microorganismos está compuesta por varias clases de enzimas diferentes que incluyen las que se identificaron como exocelobiohidrolasas (EC 3.2.1.91) ("CBH"), endoglucanasas (EC 3.2.1.4) ("EG"), b -glucosidasas (EC 3.2.1.21) ("BG"). Además, las clasificaciones fúngicas de CBH, EG y BG se pueden ampliar adicionalmente para incluir múltiples componentes en cada clasificación. Por ejemplo, se han aislado múltiples CBHs y EGs de una diversidad de fuentes bacterianas y fúngicas, incluido Trichoderma reesei que contiene 2 CBHs, es decir CBH I y CBH II, y al menos 3 EGs, es decir los componentes EG I, EG II y EG III.

El sistema de celulasa completo, que comprende componentes de cada una de las clasificaciones de CBH, EG y BG, es necesario para convertir eficazmente las formas cristalinas de la celulosa en glucosa. Los componentes aislados son bastante menos eficaces, si es que lo son, en la hidrólisis de la celulosa cristalina. Además, se observa una relación sinérgica entre los componentes de la celulasa, especialmente si son de diferentes clasificaciones. Esto quiere decir que la efectividad del sistema de celulasa completo es significativamente mayor que la suma de las contribuciones de los componentes individuales de la misma clasificación. A este respecto, se conoce en la técnica que los componentes EG y los componentes CBH interactúan sinérgicamente para degradar la celulosa con mayor eficacia. Véase, por ejemplo, Wood, Biochem. Soc. Trans., 13, páginas 407-410 (1985).

La especificidad por el sustrato y el modo de acción de los diferentes componentes de la celulasa varían según la clasificación, lo que puede explicar la sinergia entre los componentes combinados. Por ejemplo, el modo de acción actualmente aceptado de la celulasa es que los componentes endoglucanasa hidrolizan los enlaces b -1,4-glucosídicos internos, especialmente en regiones de baja cristalinidad de la celulosa, y los componentes exocelobiohidrolasa hidrolizan la celobiosa por el extremo no reductor de la celulosa. La acción de los componentes endoglucanasa facilita enormemente la acción de las exocelobiohidrolasas creando nuevos extremos de cadena que son reconocidos por los componentes exocelobiohidrolasa.

Las b -glucosidasas son componentes esenciales del sistema de celulasa y son importantes para la degradación enzimática completa de la celulosa en glucosa. Las enzimas b -glucosidasa pueden catalizar la hidrólisis de alquil- y/o aril-b -D-glucósidos, tales como metil-b -D-glucósido y p-nitrofenil-glucósido, así como de glucósidos que contienen sólo residuos carbohidrato, tales como la celobiosa. La catálisis de la celobiosa mediante la b -glucosidasa es importante porque produce glucosa para el microorganismo y porque la acumulación de celobiosa inhibe las celobiohidrolasas y las endoglucanasas, reduciendo así la velocidad de hidrólisis de celulosa a glucosa.

Puesto que las b -glucosidasas pueden catalizar la hidrólisis de numerosos sustratos diferentes, es posible usar esta enzima en una variedad de aplicaciones diferentes. Por ejemplo, algunas b -glucosidasas se pueden usar para liberar aroma de fruta mediante la catálisis de diversos glucósidos presentes en ella. De forma similar, algunas b -glucosidasas pueden hidrolizar el monoterpenil-b -glucósido de uva que, después de la hidrólisis, representa una importante fuente potencial de aroma para vino, según describió Günata et al., "Hydrolysis of Grape Monoterpenyl b -Glucosides by Various b -Glucosidases", J. Agric. Food Chem., vol. 38, páginas 1232-1236 (1990).

Además, las celulasas se pueden usar junto con levaduras para degradar biomasa a etanol, donde la celulasa degrada la celobiosa a glucosa la cual puede ser fermentada adicionalmente por las levaduras para producir etanol. Esta producción de etanol a partir de fuentes de celulosa fácilmente disponibles puede proporcionar una fuente estable y renovable de combustible. El uso de etanol como combustible presenta muchas ventajas en comparación con los productos combustibles de petróleo, tales como la reducción de la contaminación del aire en las ciudades, de la niebla contaminante y de los niveles de ozono, mejorando así el medio ambiente. Además, el etanol como fuente de combustible reduciría la dependencia de la importación de petróleo del extranjero y los suministros petroquímicos.

Sin embargo, el paso limitante más importante en la velocidad de la producción de etanol a partir de biomasa es la cantidad insuficiente de b -glucosidasa presente en el sistema para convertir eficazmente la celobiosa en glucosa. Por lo tanto, sería útil para la producción de etanol una composición de celulasa que contenga una mayor cantidad de b -glucosidasa.

Por el contrario, en algunos casos es deseable producir una composición de celulasa que sea deficiente en b -glucosidasa y que, preferentemente, carezca de ella. Tales composiciones resultarían ventajosas en la producción de celobiosa y otros celooligosacáridos.

Las b -glucosidasas están presentes en una variedad de organismos procarióticos, así como en organismos eucarióticos. Se ha clonado el gen que codifica la b -glucosidasa de varios organismos procarióticos, y el gen es capaz de dirigir la síntesis de cantidades detectables de proteína en E. coli sin la necesidad de extensa ingeniería genética, aunque en algunos casos es necesario acoplarlo con un promotor proporcionado por el vector. Sin embargo, tales organismos no producen las b -glucosidasas en cantidades comercialmente factibles.

Además, estos genes procarióticos a menudo no se pueden expresar y detectar después de la transformación del huésped eucariótico. Así, con el fin de usar cepas fúngicas, se tendría que clonar genes fúngicos usando los métodos descritos en la presente memoria o mediante la detección con el gen bgl1 de T. reesei por hibridación de ácidos nucleicos.

La contribución y bioquímica del componente b -glucosidasa en la hidrólisis de celulosa se complica por la aparente multiplicidad de formas enzimáticas asociada con T. reesei y otras fuentes fúngicas (Enari et al., "Purification of Trichoderma reesei and Aspergillus niger b -glucosidase", J. Appl. Biochem., vol. 3, páginas 157-163 (1981); Umile et al., "A constitutive, plasma membrane bound b -glucosidase in Trichoderma reesei", FEMS Microbiology Letters, vol. 34, páginas 291-295 (1986); Jackson et al., "Purification and partial characterization of an extracellular b... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para modificar la expresión de la b -glucosidasa extracelular en un hongo filamentoso, que comprende transformar dicho hongo con un vector de expresión que contiene una secuencia de ADN fúngico que:

2. Un procedimiento para potenciar la expresión de la b -glucosidasa extracelular de acuerdo con la reivindicación 1(a), en el que dicho vector de expresión comprende toda la secuencia codificante de un gen de b -glucosidasa fúngico y las secuencias necesarias para la transcripción y traducción del gen de la b -glucosidasa.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho hongo filamentoso se selecciona de los géneros Trichoderma, Aspergillus, Neurospora, Humicola y Penicillium.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho hongo filamentoso es Trichoderma reesei, Trichoderma viridae, Trichoderma koningii, Aspergillus niger, Aspergillus nidulans, Aspergillus wentii, Aspergillus oryzae, Aspergillus phoenicis, Neurospora crassa, Humicola grisea, Penicillium pinophilum o Penicillium oxalicum.

5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que dicho gen de la b -glucosidasa es un gen bgl1 procedente de Trichoderma reesei.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho gen bgl1 comprende los aminoácidos codificados por la secuencia de nucleótidos de 311 a 2679 de la Figura 1.

7. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende adicionalmente la etapa de aislamiento de los transformantes que presentan una expresión modificada de la b -glucosidasa.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, que comprende adicionalmente las etapas de:

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que dicha composición de celulasa fúngica recombinante se aísla mediante:

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que se añade un agente antimicrobiano a dicha composición de celulasa fúngica recombinante después de la filtración.

11. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que comprende adicionalmente la etapa de purificación de un producto de expresión de dicha composición de celulasa fúngica recombinante aislada.

12. Una composición de celulasa fúngica procedente de un hongo filamentoso, que comprende una b -glucosidasa extracelular alterada recombinante producida mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 únicamente en la medida en que dependan de la reivindicación 1(b).

13. Un método para producir glucosa a partir de materiales celulósicos o heteroglicanos que comprende el uso de una composición de celulasa fúngica recombinante que presenta una actividad b -glucosidasa aumentada, producida mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 únicamente en la medida en que dependan de la reivindicación 1(a).

14. Un método para degradar los materiales celulósicos presentes en desechos, biomasa o lodo que comprende el uso de una composición de celulasa fúngica recombinante que presenta una actividad b -glucosidasa aumentada, producida mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 únicamente en la medida en que dependan de la reivindicación 1(a).

15. Un procedimiento para degradar celulosa a glucosa, que comprende el uso de una composición de celulasa fúngica recombinante que presenta una actividad b -glucosidasa aumentada, producida mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 únicamente en la medida en que dependan de la reivindicación 1(a).

16. Un procedimiento para usar la composición de celulasa fúngica recombinante que presenta una actividad b -glucosidasa aumentada, producida mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 únicamente en la medida en que dependan de la reivindicación 1(a), o la b -glucosidasa purificada producida mediante el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12 en aditivos alimentarios para potenciar el sabor y el aroma.

17. Una composición de detergente que comprende una cantidad limpiadora eficaz de un tensioactivo y al menos 0,0001 por ciento en peso de una composición de celulasa fúngica recombinante que presenta una actividad b -glucosidasa aumentada, producida mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 únicamente en la medida en que dependan de la reivindicación 1(a).

18. Un método para usar la composición de celulasa que presenta una actividad b -glucosidasa aumentada, producida mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 únicamente en la medida en que dependan de la reivindicación 1(a), en el que dicho método comprende la adición de dicha composición de celulasa fúngica recombinante a levadura y biomasa para formar una mezcla y el cultivo de dicha mezcla a una temperatura suficiente y durante un periodo de tiempo suficiente para producir etanol.

19. Transformantes producidos mediante el procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7 únicamente en la medida en que dependa de la reivindicación 1(a).

20. Un método para usar los transformantes que presentan una actividad b -glucosidasa extracelular aumentada de la reivindicación 19 únicamente en la medida en que dependa de la reivindicación 1(a), comprendiendo dicho método la adición de dichos transformantes a levadura y biomasa para formar una mezcla y el cultivo de dicha mezcla a una temperatura suficiente y durante un periodo de tiempo suficiente para producir etanol.

21. El método de acuerdo con la reivindicación 18 o la reivindicación 20, en el que dicha levadura es B. clausenii, S. cerevisiae, Cellulolyticus acidothermophilium, C. brassicae, C. lustinaniae, S. uvarum o Schizosaccharomyces pombe.

22. Una secuencia de nucleótidos de un gen bgl1 cuya secuencia completa o parcial está o no marcada para el uso como sonda en la que el gen bgl1 tiene la secuencia de nucleótidos de la Figura 1.

23. Un método para usar una sonda que comprende una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la reivindicación 22, para identificar un gen de la b -glucosidasa de un hongo filamentoso.

24. El método de acuerdo con la reivindicación 23, en el que dicha sonda proviene de Trichoderma reesei.

25. El método de acuerdo con la reivindicación 23 o la reivindicación 24, en el que se pueden usar una o más sondas para identificar dicho gen de la b -glucosidasa de un hongo filamentoso.