Proteínas de unión a antígeno.

Proteína de unión a antígeno, que comprende:

a) dos cadenas pesadas modificadas de un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno,

en el que VH de cada cadena pesada se ha sustituido por VL de dicho anticuerpo, estando asociadas dichas cadenas pesadas modificadas entre sí mediante sus dominios CH3 de la parte Fc,

b) dos cadenas pesadas modificadas de dicho anticuerpo, en el que CH1 de cada cadena pesada ha sido sustituido por CL de dicho anticuerpo, estando asociadas dichas cadenas pesadas modificadas entre sí mediante sus dominios CH3 de la parte Fc, y en el que los dominios VL de las cadenas pesadas de a) están asociadas a los dominios VH de las cadenas pesadas de b), y los dominios CH1 de las cadenas pesadas de a) están asociadas a los dominios CL de las cadenas pesadas de b).

Proteínas de unión a antígeno

La presente invención se refiere a proteínas de unión a antígeno que comprenden dos partes Fc, a métodos para la 5 producción de las mismas, a composiciones farmacéuticas que contienen dichas proteínas de unión a antígenos y a usos de las mismas.

Antecedentes de la invención 10

En las últimas dos décadas se han desarrollado y evaluado diversos derivados de anticuerpo manipulado, mono- o multi-específicos, mono- o multi-valentes (ver, por ejemplo, Holliger P. et al., Nature Biotech. 23:1126-1136, 2005; Fischer N. y Léger O., Pathobiology 74:3-14, 2007) .

El documento nº WO 2006/093794 A1 da a conocer moléculas de tipo IgG monoespecíficas con un 15 entrecruzamiento de los dominios de cadena pesada y cadena ligera.

El documento nº WO 2010/145792 A1 se refiere a proteínas de unión a antígeno biespecíficas que incluyen un anticuerpo de longitud completa acoplado con fragmentos Fab con un entrecruzamiento de dominios en el anticuerpo de longitud completa y/o los fragmentos Fab adicionales. 20

El documento nº US 2010/322934 A1 se refiere a anticuerpos biespecíficos tetravalentes con un entrecruzamiento de dominios de los dominios constantes de cadena pesada y cadena ligera CH1 y CL.

El documento nº US 2004/0033561 se refiere al ADN y a la producción de monocuerpos monovalentes mediante la 25 coexpresión de una cadena pesada y una cadena pesada modificada. Sin embargo, durante la expresión se forma como producto secundario una cantidad considerable de homodímero no deseado, que resulta difícil de separar de los monocuerpos heterodiméricos deseados, ya que el homodímero y el heterodímero presentan el mismo peso molecular o pesos moleculares similares. El documento nº WO 2007/048037 se refiere a IgG monovalentes que corresponden a los monocuerpos heterodiméricos del documento nº US 2004/0033561, pero que pueden presentar 30 una fracción de etiqueta unida a la cadena pesada para una purificación más sencilla del heterodímero a partir del producto secundario homodimérico más difícil de separar.

Descripción resumida de la invención 35

La invención comprende una proteína de unión a antígeno, que comprende:

a) dos cadenas pesadas modificadas de un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno, en el que VH de cada cadena pesada se ha sustituido por VL de dicho anticuerpo, estando asociadas dichas cadenas pesadas modificadas entre sí mediante sus dominios CH de la parte Fc,

b) dos cadenas pesadas modificadas de dicho anticuerpo, en el que CH1 de cada cadena pesada ha sido 40 sustituido por CL de dicho anticuerpo, estando asociadas dichas cadenas pesadas modificadas entre sí mediante sus dominios CH1 de la parte Fc, y en el que los dominios VL de las cadenas pesadas de a) están asociadas a los dominios VH de las cadenas pesadas de b) , y los dominios CH1 de las cadenas pesadas de a) están asociadas a los dominios CL de las cadenas pesadas de b) .

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque los dominios CH3 de la parte Fc de las cadenas pesadas modificadas de a) y los dominios CH3 de la parte Fc de las cadenas pesadas modificadas de b) son del mismo isotipo.

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque los dominios CH2 y 50 CH3 de la parte Fc de las cadenas pesadas modificadas de a) y los dominios CH2 y CH3 de la parte Fc de las cadenas pesadas modificadas de b) son del mismo isotipo.

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque los dominios CH2 y CH3 de la parte Fc de las cadenas pesadas modificadas de a) y los dominios CH2 y CH3 de la parte Fc de las 55 cadenas pesadas modificadas de b) son del isotipo IgG.

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque los dominios CH2 y CH3 de la parte Fc de las cadenas pesadas modificadas de a) y los dominios CH2 y CH3 de la parte Fc de las cadenas pesadas modificadas de b) son del isotipo IgG1. 60

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque comprende:

a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1, y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 2,

a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 3, y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 4, o 5

a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 5, y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 6.

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque las dos cadenas pesadas modificadas de a) , o las dos cadenas pesadas modificadas de b) , son adicionalmente modificadas con las 10 sustituciones de aminoácidos S364G, L368F, D399K y K409D (en las que las posiciones de los aminoácidos están numeradas según el índice EU de Kabat) .

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque:

a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1, y b) dos 15 cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 2, en las que las dos cadenas pesadas modificadas de a) , o las dos cadenas pesadas modificadas de b) , se modifican adicionalmente con las sustituciones de aminoácidos S364G, L368F, D399K y K409D (en las que las posiciones de aminoácidos se numeran según el índice EU de Kabat) ,

a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 3, y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 4, en las que las dos cadenas pesadas modificadas de a) , o las dos cadenas pesadas modificadas de b) , se modifican adicionalmente con las sustituciones de aminoácidos S364G, L368F, D399K y K409D (en las que las posiciones de aminoácidos se numeran según el índice EU de Kabat) , o 25

a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 5, y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 6, en las que las dos cadenas pesadas modificadas de a) , o las dos cadenas pesadas modificadas de b) , se modifican adicionalmente con las sustituciones de aminoácidos S364G, L368F, D399K y K409D (en las que las posiciones de aminoácidos se numeran según el índice EU de Kabat) . 30

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque los dominios CH3 de la parte Fc de las cadenas pesadas modificadas de a) y los dominios CH3 de la parte Fc de las cadenas pesadas modificadas de b) son de isotipos diferentes.

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque los dominios CH3 de la parte Fc de las cadenas pesadas modificadas de a) son del isotipo IgG1, y los dominios CH3 de la parte Fc de las cadenas pesadas modificadas de b) son del isotipo IgA.

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque comprende: 40

a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 7, y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 4.

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque comprende:

a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 3, y b) dos 45 cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 8.

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque los dominios CH2 y CH3 de la parte Fc de las cadenas pesadas modificadas de a) son del isotipo IgG1, y los dominios CH2 y CH3 de la parte Fc de las cadenas pesadas modificadas de b) son del isotipo IgA. 50

En una realización, la proteína de unión a antígeno según la invención se caracteriza porque el dominio CH2 de las partes Fc de a) y b) son del isotipo IgG1 y la proteína de unión a antígeno se encuentra afucosilada, con una cantidad de fucosa de 80% o menos (preferentemente de entre 65% y 5%) de la cantidad total de oligosacáridos (azúcares) en Asn297 es del isotipo IgG1 humano. 55

La invención comprende además un método para la preparación de una proteína de unión a antígeno según la invención que comprende las etapas... [Seguir leyendo]

1. Proteína de unión a antígeno, que comprende:

a) dos cadenas pesadas modificadas de un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno, en el que VH de cada cadena pesada se ha sustituido por VL de dicho anticuerpo, estando asociadas dichas cadenas pesadas 5 modificadas entre sí mediante sus dominios CH3 de la parte Fc,

b) dos cadenas pesadas modificadas de dicho anticuerpo, en el que CH1 de cada cadena pesada ha sido sustituido por CL de dicho anticuerpo, estando asociadas dichas cadenas pesadas modificadas entre sí mediante sus dominios CH3 de la parte Fc, y en el que los dominios VL de las cadenas pesadas de a) están asociadas a los dominios VH de las cadenas pesadas de b) , y los dominios CH1 de las cadenas pesadas de a) están asociadas a los dominios CL 10 de las cadenas pesadas de b) .

2. Proteína de unión a antígeno según la reivindicación 1, caracterizada por que los dominios CH3 de la parte Fc de las cadenas pesadas modificadas de a) y los dominios CH3 de la parte Fc de las cadenas pesadas modificadas de b) son del mismo isotipo. 15

3. Proteína de unión a antígeno según la reivindicación 2, caracterizada por que los dominios CH2 y CH3 de la parte Fc de las cadenas pesadas modificadas de a) y los dominios CH2 y CH3 de la parte Fc de las cadenas pesadas modificadas de b) son del mismo isotipo.

4. Proteína de unión a antígeno según la reivindicación 3, caracterizada por que los dominios CH2 y CH3 de la parte Fc de las cadenas pesadas modificadas de a) y los dominios CH2 y CH3 de la parte Fc de las cadenas pesadas modificadas de b) son del isotipo IgG.

5. Proteína de unión a antígeno según la reivindicación 4, caracterizada por que los dominios CH2 y CH3 de 25 la parte Fc de las cadenas pesadas modificadas de a) y los dominios CH2 y CH3 de la parte Fc de las cadenas pesadas modificadas de b) son del isotipo IgG1.

6. Proteína de unión a antígeno según la reivindicación 1, caracterizada por que comprende:

a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1, y 30

b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 2,

a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 3, y

b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 4, o

a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 5, y

b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 6. 35

7. Proteína de unión a antígeno según la reivindicación 5, caracterizada por que las dos cadenas pesadas modificadas de a) , o las dos cadenas pesadas modificadas de b) , son adicionalmente modificadas con las sustituciones de aminoácidos S364G, L368F, D399K y K409D (en las que las posiciones de los aminoácidos están numeradas según el índice EU de Kabat) . 40

8. Proteína de unión a antígeno según la reivindicación 1, caracterizada por que comprende:

a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1, y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 2, en las que las dos cadenas pesadas modificadas de a) , o las dos cadenas pesadas modificadas de b) , se modifican adicionalmente con las 45 sustituciones de aminoácidos S364G, L368F, D399K y K409D (en las que las posiciones de aminoácidos se numeran según el índice EU de Kabat) ,

a) dos cadenas pesadas modificadas que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 3, y b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº4, en las que las dos cadenas pesadas modificadas de a) , 50 o las dos cadenas pesadas modificadas de b) , son modificadas adicionalmente con las sustituciones de aminoácidos S364G, L368F, D399K y K409D (en las que las posiciones de aminoácidos están numeradas según el índice EU de Kabat) , o a) dos cadenas pesadas modificadas que comprende la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 5, y 55 b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº6, en las que las dos cadenas pesadas modificadas de a) , o las dos cadenas pesadas modificadas de b) , son modificadas adicionalmente con las sustituciones de aminoácidos S364G, L368F, D399K y K409D (en las que las posiciones de aminoácidos están numeradas según el índice EU de Kabat) . 60

9. Proteína de unión a antígeno según la reivindicación 1, caracterizada por que los dominios CH3 de la parte Fc de las cadenas pesadas modificadas de a) y los dominios CH3 de la parte Fc de las cadenas pesadas modificadas de b) son de isotipo diferente.

10. Proteína de unión a antígeno según la reivindicación 9, caracterizada por que los dominios CH3 de la parte 5 Fc de las cadenas pesadas modificadas de a) son del isotipo IgG1, y los dominios CH3 de la parte Fc de las cadenas pesadas modificadas de b) son del isotipo IgA.

11. Proteína de unión a antígeno según la reivindicación 10, caracterizada por que comprende:

a) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 7, y 10

b) dos cadenas pesadas modificadas que comprenden la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 4.

12. Proteína de unión a antígeno según la reivindicación 10, caracterizada por que los dominios CH2 y CH3 de la parte Fc de las cadenas pesadas modificadas de a) son del isotipo IgG1, y los dominios CH2 y CH3 de la parte Fc de las cadenas pesadas modificadas de b) son del isotipo IgA. 15

13. Proteína de unión a antígeno monovalente según las reivindicaciones 1 a 11, caracterizada por que el dominio CH2 de las partes Fc de a) y b) son del isotipo IgG1 y la proteína de unión a antígeno se encuentra afucosilada, con una cantidad de fucosa de 80% o menos de la cantidad total de oligosacáridos (azúcares) en Asn297 es del isotipo IgG1 humano. 20

14. Composición farmacéutica que comprende una proteína de unión a antígeno según las reivindicaciones 1 a 13.

15. Proteína de unión a antígeno según las reivindicaciones 1 a 13, destinada a la utilización en el tratamiento 25 del cáncer.

16. Utilización de proteína de unión a antígeno según las reivindicaciones 1 a 13 para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer.

17. Método para la preparación de una proteína de unión a antígeno según las reivindicaciones 1 a 13, que comprende las etapas siguientes:

a) transformar una célula huésped con vectores que comprenden moléculas de ácidos nucleicos codificantes de una proteína de unión a antígeno según las reivindicaciones 1 a 13,

b) cultivar la célula huésped bajo condiciones que permiten la síntesis de dicha molécula de proteína de unión a 35 antígeno, y

c) recuperar dicha molécula de proteína de unión a antígeno a partir de dicho cultivo.

18. Ácido nucleico codificante de una proteína de unión a antígeno según las reivindicaciones 1 a 13.

19. Vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 18.

20. Célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 19.