Proteínas de CTLA4 y sus usos.

Un polipéptido variante de CTLA4 que tiene mayor afinidad para CD80 y/o CD86 que el dominio de unión de CTLA4 de los aminoácidos 21-112 de SEC ID Nº:

1; comprendiendo dicho polipéptido variante de CTLA4 una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia con respecto a dicho dominio de unión de CTLA4 y la sustitución de aminoácido K28H en comparación con SEC ID Nº:1.

Proteínas de CTLA4 y sus usos

1. Referencia cruzada a solicitudes relacionadas 1.1 Listado de Secuencias

La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias que se ha enviado en formato ASCII por medio de la Web del EFS.

2. Campo de la invención

La presente invención se refiere a proteínas de CTLA4, a composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas de CTLA4, y a los usos terapéuticos de tales proteínas.

3. Antecedentes

Los las células linfocíticas T desempeñan un papel crítico en la inmunidad mediada por células proporcionando una respuesta adaptativa a patógenos específicos. La activación de células T depende de la activación de al menos dos rutas de señalización, una que es específica de antígeno y la otra que no es específica de antígeno. Una respuesta antigénica de células T auxiliares requiere la activación de una primera ruta de señalización mediante la unión del receptor de células T a un antígeno unido a MHC (complejo mayor de histocompatibilidad) sobre la superficie de la célula presentadora de antígeno (APC). La respuesta antigénica también requiere la activación de una segunda ruta de señalización, que produce una señal co-estimuladora, mediante la unión de la proteína CD28 sobre la superficie de la célula T a CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2) sobre la superficie de la APC. Debido a que la señal específica de antígeno no es suficiente para generar una respuesta antigénica completa, la unión receptor de célula T/antígeno MHC sin co-estimulación puede conducir a la inactivación clonal o anergia. (Véase, por ejemplo, Jenkins etal., 1993, Curr. Opin. Immunol. 5:361). Las rutas co-estimuladoras no solamente desempeñan un papel en la activación y la diferenciación de las células T, sino también en la migración a los tejidos y la inducción de tolerancia periférica. (Véase Salomón etal., 2001, Ann. Rev. Immunol. 19:225.)

Las células T activadas también expresan sobre su superficie celular el antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos 4 (CTLA4), un homólogo de CD28 que se une a CD80 y CD86 con una afinidad más alta. La expresión de CTLA4 da como resultado la unión competitiva de CD80 y CD86, bloqueando la interacción de CD80/86-CD28 y terminando la activación de la célula T. Debido a que estas rutas de señalización determinan la magnitud de una respuesta de células T para un antígeno, así como las respuestas aguas abajo para un antígeno, los agentes que modulan una o más señales de coestimulación, por ejemplo, bloqueando una o más de las interacciones entre CD80/CD86 y CD28 y/o CTLA4, pueden ser eficaces en el tratamiento de trastornos que son el resultado las respuestas inmunitarias mediadas por células alteradas. (Véase, por ejemplo, Mueller, etal., 1989, Annu. Rev. Immunol. 7:445).

Los agentes adecuados para la interrupción de la interacción de CD80/86-CD28 incluyen anticuerpos y proteínas de fusión. Por ejemplo, en un modelo de encefalitis autoinmunitaria experimental (EAE), se bloquearon las células T usando anticuerpos anti-CD80 y anti-CD86. (Véase Racke, et al., 1995, J. Clin. Invest. 96:2195). En otro ejemplo, se usaron los anticuerpos anti-CD80 y anti-CD86 para bloquear las respuestas inmunitarias de tipo 2 in vivo (es decir, las respuestas inmunitarias mediadas por anticuerpos de IgG y dirigidas contra antígenos de la superficie celular o de la matriz) y la producción de IL-4. (Greenwald, et al., 1997, J. Immunol. 158:4088) se ha demostrado que las proteínas de fusión CD28-lg interaccionan con CD80 y/o CD86 en las células dendríticas y las activan, lo que da como resultado una actividad adyuvante del CD28 soluble que produce respuestas inmunitarias mediadas por células T potenciadas in vivo. (Orabona etal., 2004, Nature Immunol. 5(11 ):1134). Como alternativa, las proteínas de fusión de CTLA4-lg se han usado para romper las interacciones CD80/86-CD28 (Véase, por ejemplo, Mclntyre, et al., 2005, Drugs of the Future, 30:873).

Los estudios recientes de la activación de las células T y la ruta co-estimuladora indican que CD80 y CD86 pueden desempeñar papeles distintos en las respuestas inmunitarias, y especialmente en la autoinmunidad. Por lo tanto, se ha demostrado que el bloqueo solamente de la unión a uno de CD80 o CD86 a CD28 produce efectos dispares in vivo, dependiendo de la enfermedad que se estudie y el tiempo de administración (Véase Salomón, 2001, Annu. Rev. Immunol. 19:225; Kuchroo, etal., 1995, Cell 80:707; Racke, etal., 1995, J. Clin. Invest. 96:2195; Lenschow et al., 1995, J. Exp. Med. 181:1145; y Greenwald, etal., J. Immunol., 1997, 158:4088).

Las solicitudes PTC publicadas WO 2008/047150 y WO 2009/058564 divulgan proteínas variantes y mutantes de CTLA4 respectivamente, para el tratamiento de trastornos, por lo que la atenuación de la respuesta de las células T sería beneficiosa.

Los anticuerpos que se unen a CTLA4 y rompen la inhibición de las respuestas de células T mediadas por CD28 están actualmente en desarrollo para el tratamiento de diversos cánceres. Ipilimumab, un anticuerpo anti-CTLA4

IgGi humano, está en ensayos en Fase III para melanoma y en ensayos en Fase II para cáncer de mama y cáncer de próstata. Tremellmumab, un anticuerpo anti-CTLA4 lgG2 humano, está en ensayos en Fase II para cáncer de próstata, cáncer de vejiga, y cáncer colorrectal.

Las proteínas de fusión que se unen a CD80 y/o CD86 y rompen la interacción con CTLA4 y CD28 son buenos candidatos para el desarrollo de agentes inmunomoduladores. Las proteínas de fusión permiten la modificación de proteínas con, por ejemplo, solubilidad, estabilidad, capacidad de administración, y/o actividad mejorada. Uno de tales agentes inmunomoduladores es la proteína de fusión soluble abatacept (Orencia®), desarrollada para el tratamiento de la artritis reumatoide (AR) y la artritis juvenil idiopátlca, trastornos autoinmunitarios que atacan a las articulaciones, causando una hinchazón dolorosa que puede dar como resultado eventualmente la erosión del hueso y la deformidad de las articulaciones.

Abatacept es una proteína de fusión de CTLA4-lg que consiste en el dominio extracelular de la CTLA4 humana y una porción modificada de Fe de inmunoglobulina Gi (IgGi) humana que Incluye la bisagra, los dominios CH2, y CH3. Se cree que el dominio de CTLA4 proporciona actividad de unión y la porción Fe proporciona estabilidad, solubilidad y capacidad de administración. El abatecept inhibe la Interacción de CD28 en las células T con las proteínas CD80 y/o CD86 en las ACP, dando como resultado por lo tanto la Inhibición de la activación de células T. (Véase, por ejemplo, Schwartz, 1992, Cell 71:1065). Por consiguiente, la administración de abatacept da como resultado una disminución de la proliferación, activación y señalización de células T, y atenúa la respuesta autolnmunitaria en artritis reumatoide. Una proteína de fusión de CTLA4-lg soluble recombinante de segunda generación conocida como belatacept difiere del abatacept en dos aminoácidos y tiene una afinidad de unión mayor para CD80 y CD86. Belatacept está en curso en ensayos de Fase lll para el uso en trasplantes de riñón y otros órganos. (Véase Llnsley et al., 2009, Immunol. Reviews 229:307-321). Una tercera proteína de fusión, MAXY-4, una proteína derivada de abatacept pero que tiene unión aumentada para las dianas de CTLA4, está actualmente en desarrollo preclínico en Perseld Therapeutics, LLC y Astellas Pharma, Inc. para el tratamiento de enfermedades autolnmunitarias y rechazo de trasplantes.

La terapia con abatacept puede tener un coste prohibitivo. Las variantes de abatacept de afinidad más alta podrían reducir la dosis terapéutica eficaz requerida y por lo tanto reducir el coste de la terapia. Además, debido a que se requiere menos agente para alcanzar un resultado beneficioso, el riesgo de desarrollar una respuesta inmunogénica para el agente en sí mismo también puede disminuir. También pueden reducirse otros efectos secundarios. Existe una necesidad de proporcionar proteínas de fusión mejoradas con distinta unión a las proteínas CD80 y CD86, por ejemplo, generando las variantes con una afinidad relativa más alta para una isoforma con respecto a la otra. Tales variantes mejoradas pueden proporcionar una modulación inmunitaria dirigida para afecciones y patologías específicas. También pueden reducirse los efectos adversos o la exacerbación de las respuestas inmunitarias observadas en algunos casos de terapias con CTLA4-lg y anticuerpo anti-CTLA4.

La citación o identificación de cualquier referencia en la Sección 2 o en cualquier otra sección de esta solicitud no se interpretará como una admisión de que tal referencia está disponible como técnica anterior a la... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido variante de CTLA4 que tiene mayor afinidad para CD80 y/o CD86 que el dominio de unión de CTLA4 de los aminoácidos 21-112 de SEC ID N°:1; comprendiendo dicho polipéptido variante de CTLA4 una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia con respecto a dicho dominio de unión de CTLA4 y la sustitución de aminoácido K28H en comparación con SEC ID N°:1.

2. El polipéptido variante de CTLA4 de la reivindicación 1, que comprende una o más de las sustituciones de aminoácidos A29H, L58G, K93Q, K93M y L96K en comparación con la secuencia del polipéptido de SEC ID N°:1.

3. El polipéptido variante de CTLA4 de la reivindicación 1, que comprende la sustitución de aminoácidos T51N o T51Y en comparación con un polipéptido de secuencia SEC ID N°:1.

4. El polipéptido variante de CTLA4 de la reivindicación 1, que comprende la sustitución de aminoácido L61H en comparación con un polipéptido de secuencia SEC ID N°:1.

5. El polipéptido variante de CTLA4 de la reivindicación 1, que comprende la sustitución de aminoácido L104E en comparación con un polipéptido de secuencia SEC ID N°:1.

6. El polipéptido variante de CTLA4 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende:

(i) hasta 10, hasta 9, hasta 8, hasta 7, hasta 6, hasta 5, hasta 4, o hasta 3 o hasta 2 sustituciones de

aminoácidos en comparación con los aminoácidos 21 a 112 de SEC ID N°:1 y/o

(ii) hasta 10, hasta 9, hasta 8, hasta 7, hasta 6, hasta 5, hasta 4, o hasta 3 o hasta 2 sustituciones de

aminoácidos en comparación con los aminoácidos 1 a 124 de SEC ID N°:1.

7. El polipéptido variante de CTLA4 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que es una proteína de fusión.

8. El polipéptido variante de CTLA4 de la reivindicación 7, donde la proteína de fusión comprende un dominio extracelular de CTLA4 unido a una región constante de ¡nmunoglobulina y opcionalmente una secuencia señal.

9. El polipéptido variante de CTLA4 de la reivindicación 7 o reivindicación 8, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 90%, al menos un 95%, al menos un 97%, al menos un 98% o al menos un 99% de identidad de secuencia con respecto a abatacept (SEC ID N°:6).

10. El polipéptido variante de CTLA4 de la reivindicación 8, donde el dominio extracelular de CTLA4 y la región constante de la ¡nmunoglobulina están unidas por medio de una bisagra.

11. El polipéptido variante de CTLA4 de una cualquiera de las reivindicaciones 8, 9 o 10, donde el dominio constante de ¡nmunoglobulina se selecciona de una lgG1, una lgG2 e lgG3 o una lgG4, preferentemente donde la región constante de la ¡nmunoglobulina es una lgG1.

12. El polipéptido variante de CTLA4 de la reivindicación 11, donde al menos un resto de cisterna en la región constante de ¡nmunoglobulina se ha sustituido por otro aminoácido para eliminar uno o más enlaces disulfuro formados entre dos cadenas de Ig, opcionalmente donde al menos un resto de cisterna se ha sustituido por una serina.

13. Un conjugado de polipéptido variante de CTLA4-fármaco que comprende un polipéptido variante de CTLA4 de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

14. Una composición farmacéutica que comprende un polipéptido de CTLA4 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 o un conjugado de polipéptido de CTLA4-fármaco de acuerdo con la reivindicación 13, y un transportador farmacéuticamente aceptable.

15. Un polipéptido de CTLA4 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, un conjugado de polipéptido de CTLA4-fármaco de acuerdo con la reivindicación 13, o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14 para su uso en una cantidad terapéuticamente eficaz en el tratamiento de cáncer en un ser humano.

16. Un polipéptido CTLA4 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, un conjugado de polipéptido de CTLA4-fármaco de acuerdo con la reivindicación 13, o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14 para su uso en una cantidad terapéuticamente eficaz en el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria.

17. El polipéptido de CTLA4, conjugado de polipéptido de CTLA4-fármaco o composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la reivindicación 16, donde la enfermedad autoinmunitaria se selecciona de artritis reumatoide y artritis juvenil idiopática.

5 18. Un polipéptido de CTLA4 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, un conjugado de

polipéptido de CTLA4-fármaco de acuerdo con la reivindicación 13, o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 14 para su uso en una cantidad terapéuticamente eficaz para tratar o prevenir el rechazo de un trasplante de injerto de células, órganos o tejidos en un ser humano.

10 19. El polipéptido de CTLA4, el conjugado de polipéptido de CTLA4-fármaco o la composición farmacéutica para su

uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, donde, antes de la administración, la expresión de CTLA4 se ensayará en un tejido del paciente afectado por dicho cáncer, enfermedad autoinmunitaria o rechazo, respectivamente.