Procedimiento rápido de selección de células (líneas) objetivo.

Un proceso in vitro para la predicción de datos de rendimiento de cultivo celular de al menos una célula de muestra,

que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una muestra de al menos una célula de muestra, datos de rendimiento de cultivo celular de una célula estándar y datos de EM (espectrometría de masas) en bruto de la célula estándar,

(b) someter la muestra de la al menos una célula de muestra a un análisis de EM para obtener datos de EM de muestra en bruto de la misma,

(c) someter el estándar en bruto y los datos de EM de muestra en bruto a al menos un primer método de procesamiento de la señal de EM para obtener perfiles de EM de estándar pretratado y de muestra y

(d) someter los datos de rendimiento de cultivo celular de la célula estándar de la etapa (a) y los perfiles de EM de estándar y de muestra pretratados obtenidos en la etapa (c) a un segundo método de procesamiento de la señal de EM incluyendo una evaluación comparativa basada en PLS-DA (análisis discriminatorio por mínimos cuadrados parciales) para predecir los datos de rendimiento de cultivo celular de la al menos una célula de muestra,

en el que los datos de rendimiento de cultivo celular son datos de productividad celular específica, recuento integral de células viables o concentración de producto celular.

Procedimiento rápido de selección de células (líneas) objetivo

La presente invención se refiere a un proceso in vitro para la predicción de los datos de rendimiento de cultivo celular de células de muestra, a un proceso in vitro para el aislamiento de dichas células y a un dispositivo para la predicción de datos de rendimiento de cultivo celular de células de muestra, en el que los datos de rendimiento de cultivo celular son la productividad celular específica, para el recuento integral de células viables o para los datos de concentración del producto celular.

Según la técnica anterior, los procedimientos para el aislamiento de líneas celulares recombinantes de mamífero con las propiedades de elaboración deseadas son ineficaces tanto desde el punto de vista de los recursos como por la capacidad para aislar las combinaciones específicas de las características deseadas.

Por ejemplo, Adrichem y col. (Anal. Chem., 1998, 7, 923 - 93) desvelan las investigaciones sobre patrones de proteínas y células de mamífero en sobrenadantes de cultivo mediante espectrometría de masas de desorción/ionización por láser asistida por matriz (espectrometría de masas MALDI). Dicha espectrometría de masas MALDI puede usarse para la caracterización de proteínas mediante la monitorización de las proteínas que han sido excretadas al medio o que están presentes en Usados celulares. El intervalo de masas detectable por la espectrometría de masas MALDI es desde 16. hasta varios cientos de miles de Dalton, preferentemente desde varios cientos a varios miles. Los resultados así obtenidos son complementarios de la electroforesis de SDS-PAGE estándar. Por lo tanto, estos procedimientos pueden usarse, por ejemplo, para monitorizar el cultivo a gran escala de células de hibridoma que expresan un anticuerpo del tipo IgG.

Zhang y col. (J. Am. Soc. Mass Spectrom., 26, 17, 49 - 499) desvelan la identificación de líneas celulares de mamífero usando espectrometría de masas MALDI-TOF y CL-ESI-EM/EM. Se establece que la espectrometría de masas MALDI-TOF es eficaz para la caracterización de péptidos directamente a partir de una única célula. El análisis mediante CL-ESI-EM/EM puede proporcionar una información útil de la secuencia después de una digestión tríptica de las muestras celulares. Se averiguó que producía unos patrones de MALDI-EM únicos y reproducibles, que pueden ser usados como huella molecular para identificar y distinguir las diferentes líneas celulares medidas. Sin embargo, los espectros de EM obtenidos se comparaban visualmente sobre la base de los claros picos visibles de EM para distinguir los tres diferentes tipos celulares de mamífero. Alternativamente, Zhang y col. demuestran que una técnica diferente - una combinación de cromatografía líquida seguida de una ionización por electronebulización y espectroscopia de masas en tándem (CL-ESI-EM/EM), para la que es necesario digerir las muestras - también es útil para arrojar luz sobre las diferencias en los perfiles de los proteomas.

Feng y col. (Rapid Commun. Mass Spectrom., 21, 24, 1226 - 123) desvelan una rápida caracterización de células CHO altas/bajas productoras usando una desorción/ionización por láser asistida por matriz con analizador del tiempo de vuelo (MALDI-TOF). El proceso desvelado en este documento es capaz de distinguir entre células altas y bajas productoras cuando son producidas en el mismo cultivo a la misma escala mediante la aplicación de procedimientos estadísticos, a saber, el análisis de los componentes principales (PCA) y los mínimos cuadrados parciales lineales (PLS), para analizar los espectros de MALDI-TOF. Especialmente, el procedimiento según Feng y col. permite distinguir entre datos de productividad procedentes de diferentes líneas celulares que producen una proteína recombinante de IFN-gamma a la misma escala, es decir, crecidas a baja escala. Según Feng y col., esta metodología podría usarse posiblemente para predecir la productividad celular. La PLS lineal usada deriva su utilidad de la capacidad para analizar datos con muchas variables, lo que es relevante para hallar subfamilias de líneas celulares a una escala dada.

Según se mencionó anteriormente, los procedimientos según la técnica anterior, especialmente los de Feng y col., simplemente enseñan que los datos de MALDI-TOF que son analizados mediante programas estadísticos, a saber, PLS y PCA, pueden usarse para la diferenciación entre células altas y bajas productoras a una escala de cultivo dada.

Sin embargo, la técnica anterior no consigue enseñar un procedimiento que prediga las características celulares de una célula desconocida en una etapa posterior del aumento de escala, en particular, en biorreactores de gran volumen, mientras estas células aún se están cultivando en un medio con un bajo volumen. Especialmente, los conocidos programas estadísticos de PCA y PLS producen unos datos que son insuficientes para ser usados como base para una predicción precisa y fiable de las características celulares en una etapa posterior de aumento de escala.

Una línea celular que expresa en la etapa temprana un balance específico de proteínas pueden mostrar, por ejemplo, una elevada productividad en esta etapa, pero después del aumento de escala, en la etapa del biorreactor, esta productividad puede deteriorarse debido a diferentes factores que son, entre otros, fuerzas de cizallamiento, efectos del volumen, diferentes tipos o formatos de termentador, parámetros de cultivo, por ejemplo, pH, y diferencias de densidad celular controladas por gas.

Por lo tanto, existe una necesidad de un procedimiento con la capacidad de cribar rápidamente grandes cantidades de líneas celulares tempranamente en el desarrollo de la línea celular y cultivadas únicamente en pequeños volúmenes, que sea capaz de predecir las características específicas de crecimiento y de producción, por ejemplo, unas productividades volumétricas aumentadas de dicha línea celular a una escala de cultivo dada y deseada, en particular a una escala de biorreactor, lo que significa a gran escala de volumen.

Por lo tanto, el problema técnico subyacente de la presente invención es proporcionar un procedimiento para superar los problemas identificados anteriormente, en particular, proporcionar un procedimiento para la predicción del cultivo celular, en particular de un biorreactor, del rendimiento de una célula con características celulares desconocidas, en particular ya en una etapa temprana del aumento de escala, siendo adicionalmente ahorrador de tiempo y reductor de coste, pero con una elevada precisión de predicción para dicho rendimiento en un cultivo a una escala en gran volumen y/o en unas condiciones de alta productividad, en particular a una escala de un biorreactor.

Este problema es resuelto por las reivindicaciones independientes de la presente invención.

Por lo tanto, la presente invención proporciona un proceso in vitro para la predicción de datos de rendimiento de cultivo celular de al menos una célula de muestra que comprende las etapas:

a) proporcionar una muestra de al menos una célula de muestra, preferentemente cultivada en un volumen pequeño de un medio, datos de rendimiento de cultivo celular de una célula convencional y datos en bruto de EM (espectrometría de masas) de una célula convencional,

b) someter a la muestra de la al menos una célula de muestra a un análisis de EM para obtener una muestra de datos de EM en bruto de la misma,

c) someter a los datos de EM en bruto de patrón y en bruto de muestra a al menos un primer método de procesamiento de señal de EM para obtener perfiles de EM de patrón y de muestra pretratados y

d) someter a los datos de rendimiento de cultivo celular de la célula patrón de la etapa a) y los perfiles de EM de muestra y patrón pretratados obtenidos en la etapa c) a un segundo método de procesamiento de señales de señal de EM incluyendo, preferentemente, un análisis de datos que comprende una evaluación comparativa basada en PLS-DA (un análisis discriminatorio por mínimos cuadrados parciales) para predecir los datos de rendimiento del cultivo celular de la al menos una célula de muestra,

en el que los datos de rendimiento de cultivo celular son datos de productividad específica, recuento integral de células viables o concentración de producto celular.

La presente invención proporciona por lo tanto un ventajoso proceso in vitro para la predicción precisa y fiable de datos de rendimiento de cultivo celular, preferentemente de biorreactor, de al menos una célula de muestra con datos de rendimiento de cultivo celular, preferentemente de biorreactor, que permitan la predicción que ahorra tiempo y reduce costees de datos de rendimiento... [Seguir leyendo]

1. Un proceso in vitro para la predicción de datos de rendimiento de cultivo celular de al menos una célula de muestra, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una muestra de al menos una célula de muestra, datos de rendimiento de cultivo celular de una célula estándar y datos de EM (espectrometría de masas) en bruto de la célula estándar,

(b) someter la muestra de la al menos una célula de muestra a un análisis de EM para obtener datos de EM de muestra en bruto de la misma,

(c) someter el estándar en bruto y los datos de EM de muestra en bruto a al menos un primer método de procesamiento de la señal de EM para obtener perfiles de EM de estándar pretratado y de muestra y

(d) someter los datos de rendimiento de cultivo celular de la célula estándar de la etapa (a) y los perfiles de EM de estándar y de muestra pretratados obtenidos en la etapa (c) a un segundo método de procesamiento de la señal de EM incluyendo una evaluación comparativa basada en PLS-DA (análisis discriminatorio por mínimos cuadrados parciales) para predecir los datos de rendimiento de cultivo celular de la al menos una célula de muestra,

en el que los datos de rendimiento de cultivo celular son datos de productividad celular específica, recuento integral de células viables o concentración de producto celular.

2. El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la célula se selecciona del grupo que consiste en líneas celulares humanas, líneas celulares animales, líneas celulares vegetales, células de hongos, células bacterianas, células de levaduras y células madre.

3. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la célula es una línea celular de CHO o una línea celular de CHO-K1.

4. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el análisis de EM de la etapa (b) es MALDI-TOF.

5. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra de las células de muestra sometidas a la etapa (b) comprende desde ,15 x 16 hasta ,625 x 16 células.

6. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los datos de EM de muestra en bruto obtenidos en la etapa (b) y los datos de EM de estándar en bruto proporcionados en la etapa (a) son señales procesadas mediante una operación seleccionada del grupo que consiste en corrección de la línea de base, normalización, alineamiento, filtrado y recortado.

7. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los perfiles de EM de estándar y de muestra pretratados obtenidos en la etapa (c) se analizan visualmente.

8. El proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la célula de muestra con los datos de rendimiento de cultivo celular evaluados en la etapa (d) se cultiva en un cultivo celular para verificar sus datos de rendimiento de cultivo celular.

9. El proceso de acuerdo con la reivindicación 8, en el que los perfiles de EM de muestra en bruto obtenidos en la etapa (b) y los datos de rendimiento de cultivo celular verificados de la célula de muestra se usan en la etapa (a) como datos de EM estándar y como datos de rendimiento de cultivo celular a partir de una célula estándar.

1. Un proceso in vitro para el aislamiento de una célula con datos de rendimiento de cultivo celular deseados, en el que se lleva a cabo un proceso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y se aísla la célula deseada.

11. Un dispositivo que está adaptado para proporcionar una predicción de datos de rendimiento de cultivo celular cuando se administra con una muestra de al menos una célula de muestra que comprende las siguientes características técnicas:

(a) un medio adaptado para someter una muestra de la al menos una célula de muestra a análisis de EM (espectrometría de masas) para obtener datos de EM de muestra en bruto de la misma,

(b) un medio adaptado para someter un estándar en bruto y los datos de EM de muestra en bruto a al menos un primer método de procesamiento de la señal de EM para obtener perfiles de EM de estándar y de muestra pretratados y

(c) un medio adaptado para someter los datos de rendimiento de cultivo celular de una célula estándar y los perfiles de EM de estándar a un segundo método de procesamiento de la señal de EM que incluye una evaluación comparativa basada en la PLS-DA (análisis discriminatorio por mínimos cuadrados parciales) para predecir los datos de rendimiento de cultivo celular de la célula de muestra,

en donde los datos de rendimiento de cultivo celular son datos de productividad celular específica, recuento integral de células viables o concentración de producto celular.