Procedimiento rápido de selección de células (líneas celulares) dirigida.

Un proceso in vitro para la predicción de los datos de productividad específica celular,

de recuento integral decélulas viables o de concentración del producto celular de al menos una célula de muestra en una etapa tardía de laamplificación, en particular en biorreactores de gran volumen, mientras la al menos una célula de muestra escultivada en un medio con un bajo volumen que comprende las etapas:

(a) proporcionar (i) una muestra de la al menos una célula de muestra, (ii) datos de productividad específicacelular, recuento integral de células viables o concentración del producto celular a partir de una célula estándar y(iii) datos en bruto estándar de EM (espectrometría de masas) a partir de la célula estándar,

(b) someter la muestra de la al menos una célula de muestra a un análisis por EM para obtener los datos demuestra en bruto de la EM de la misma,

(c) someter los datos de la EM en bruto del estándar y en bruto de la muestra a al menos un primerprocedimiento de procesado de la señal de la EM para obtener unos perfiles de la EM pretratados del estándar yde la muestra, y

(d) someter los datos de la productividad específica celular, de recuento integral de células viables o deconcentración del producto celular procedentes de la célula estándar de la etapa (a) y los perfiles de la EMpretratados de la muestra y del estándar obtenidos en la etapa (c) a un segundo procedimiento de procesado dela señal de la EM que incluye un PLS - DA (un análisis discriminatorio por mínimos cuadrados parciales) basadoen la evaluación comparativa, para predecir los datos de productividad específica celular, de recuento integral decélulas viables o de concentración del producto celular de la al menos una célula de muestra.

Procedimiento rápido de selección de células (líneas celulares) dirigida

La presente invención se refiere a un proceso in vitro para la predicción de la productividad específica celular, del recuento integral de células viables o de los datos de concentración del producto celular de células de muestra, a un proceso in vitro para el aislamiento de dichas células y a un dispositivo para la predicción de la productividad celular específica, para el recuento integral de células viables o para los datos de concentración del producto celular de células de muestra.

Según la técnica anterior, los procedimientos para el aislamiento de líneas celulares recombinantes de mamífero con las propiedades de elaboración deseadas son ineficaces tanto desde el punto de vista de los recursos como por la capacidad para aislar las combinaciones específicas de las características deseadas.

Por ejemplo, Adrichem y col. (Anal. Chem., 1998, 70, 923 - 930) desvelan las investigaciones sobre patrones de proteínas y células de mamífero en sobrenadantes de cultivo mediante espectrometría de masas de desorción/ionización por láser asistida por matriz (espectrometría de masas MALDI) . Dicha espectrometría de masas MALDI puede usarse para la caracterización de proteínas mediante la monitorización de las proteínas que han sido excretadas al medio o que están presentes en lisados celulares. El intervalo de masas detectable por la espectrometría de masas MALDI es desde 16.000 hasta varios cientos de miles de Daltons. Los resultados así obtenidos son complementarios de la electroforesis de SDS-PAGE estándar. Por lo tanto, estos procedimientos pueden usarse, por ejemplo, para monitorizar el cultivo a gran escala de células de hibridoma que expresan un anticuerpo del tipo IgG.

Zhang y col. (J. Am. Soc. Mass Spectrom., 2006, 17, 490 - 499) desvelan la identificación de líneas celulares de mamífero usando espectrometría de masas MALDI - TOF y CL - ESI - EM / EM. Se establece que la espectrometría de masas MALDI - TOF es eficaz para la caracterización de péptidos directamente a partir de una única célula. El análisis mediante CL - ESI - EM / EM puede proporcionar una información útil de la secuencia después de una digestión tríptica de las muestras celulares. Se averiguó que producía unos patrones de MALDI - EM únicos y reproducibles, que pueden ser usados como huella molecular para identificar y distinguir las diferentes líneas celulares medidas. Sin embargo, los espectros de EM obtenidos se comparaban visualmente sobre la base de los claros picos visibles de EM para distinguir los tres diferentes tipos celulares de mamífero. Alternativamente, Zhang y col. demuestran que una técnica diferente - una combinación de cromatografía líquida seguida de una ionización por electronebulización y espectroscopía de masas en tándem (CL - ESI - EM / EM) , para la que es necesario digerir las muestras - también es útil para arrojar luz sobre las diferencias en los perfiles de los proteomas.

Feng y col. (Rapid Commun. Mass Spectrom., 2010, 24, 1226 - 1230) desvelan una rápida caracterización de células CHO altas/bajas productoras usando una desorción/ionización por láser asistida por matriz con analizador del tiempo de vuelo (MALDI - TOF) . El proceso desvelado en este documento es capaz de distinguir entre células altas y bajas productoras cuando son producidas en el mismo cultivo a la misma escala mediante la aplicación de procedimientos estadísticos, a saber, el análisis de los componentes principales (PCA) y los mínimos cuadrados parciales lineales (PLS) , para analizar los espectros de MALDI - TOF. Especialmente, el procedimiento según Feng y col. permite distinguir entre datos de productividad procedentes de diferentes líneas celulares que producen una proteína recombinante de IFN-gamma a la misma escala, es decir, crecidas a baja escala. Según Feng y col., esta 45 metodología podría usarse posiblemente para predecir la productividad celular. La PLS lineal usada deriva su utilidad de la capacidad para analizar datos con muchas variables, lo que es relevante para hallar subfamilias de líneas celulares a una escala dada.

Según se mencionó anteriormente, los procedimientos según la técnica anterior, especialmente los de Feng y col., simplemente enseñan que los datos de MALDI - TOF que son analizados mediante programas estadísticos, a saber, PLS y PCA, pueden usarse para la diferenciación entre células altas y bajas productoras a una escala de cultivo dada.

Sin embargo, la técnica anterior no consigue enseñar un procedimiento que prediga las características celulares de 55 una célula desconocida en una etapa posterior de la amplificación, en particular, en biorreactores de gran volumen, mientras estas células aún se están cultivando en un medio con un bajo volumen. Especialmente, los conocidos programas estadísticos de PCA y PLS producen unos datos que son insuficientes para ser usados como base para una predicción precisa y fiable de las características celulares en una etapa posterior de amplificación.

Una línea celular que expresa en la etapa temprana un balance específico de proteínas pueden mostrar, por ejemplo, una elevada productividad en esta etapa, pero después de la amplificación, en la etapa del biorreactor, esta productividad puede deteriorarse debido a diferentes factores que son, entre otros, fuerzas de cizallamiento, efectos del volumen, diferentes tipos o formatos de fermentador, parámetros de cultivo, por ejemplo, pH, y diferencias de densidad celular controladas por gas.

Por lo tanto, existe una necesidad de un procedimiento con la capacidad de cribar rápidamente grandes cantidades de líneas celulares tempranamente en el desarrollo de la línea celular y cultivadas únicamente en pequeños volúmenes, que sea capaz de predecir las características específicas de crecimiento y de producción, por ejemplo, unas productividades volumétricas aumentadas de dicha línea celular a una escala de cultivo dada y deseada, en particular a una escala de biorreactor, lo que significa a gran escala de volumen.

Por lo tanto, el problema técnico subyacente de la presente invención es proporcionar un procedimiento para superar los problemas identificados anteriormente, en particular, proporcionar un procedimiento para la predicción del cultivo celular, en particular de un biorreactor, del rendimiento de una célula con características celulares desconocidas, en particular ya en una etapa temprana de la amplificación, siendo adicionalmente ahorrador de tiempo y reductor de coste, pero con una elevada precisión de predicción para dicho rendimiento en un cultivo a una escala en gran volumen y/o en unas condiciones de alta productividad, en particular a una escala de un biorreactor.

Este problema es resuelto por las reivindicaciones independientes de la presente invención, que definen el procedimiento y el dispositivo en su sentido más amplio.

La presente invención proporciona por lo tanto un ventajoso proceso in vitro para la predicción precisa y fiable de la productividad celular específica, del recuento celular integral viable o de los datos de concentración del producto celular de al menos una célula de muestra con una productividad celular específica desconocida, un recuento integral de células viables o datos de concentración del producto celular, que permite el ahorro de tiempo y la reducción de costes en la predicción de la productividad celular específica en particular, del recuento integral de células viables o de los datos de concentración del producto celular. También puede prepararse una célula, y en particular aislarse, mediante dicho procedimiento, en el que dicha célula está caracterizada particularmente por un cultivo celular deseado, preferiblemente en biorreactor, unos datos de rendimiento, tales como una elevada productividad. Adicionalmente, la presente invención proporciona un dispositivo adaptado para proporcionar una predicción de la productividad celular específica, del recuento integral de células viables o de los datos de concentración del producto celular, cuando se suministra una muestra de al menos una célula de muestra que comprende: (a) un medio adaptado para someter una muestra de la al menos una célula de muestra a un análisis por EM (espectrometría de masas) para obtener unos datos de muestra en bruto de EM de la misma, (b) un medio adaptado para someter los datos en bruto de un estándar y en bruto de la muestra de EM a al menos un primer procedimiento de procesado de la señal de EM para obtener unos perfiles de EM pretratados del estándar y de la muestra, y (c) un medio adaptado para someter los datos de la productividad específica celular, del recuento integral de células viables... [Seguir leyendo]

1. Un proceso in vitro para la predicción de los datos de productividad específica celular, de recuento integral de células viables o de concentración del producto celular de al menos una célula de muestra en una etapa tardía de la amplificación, en particular en biorreactores de gran volumen, mientras la al menos una célula de muestra es cultivada en un medio con un bajo volumen que comprende las etapas:

(a) proporcionar (i) una muestra de la al menos una célula de muestra, (ii) datos de productividad específica celular, recuento integral de células viables o concentración del producto celular a partir de una célula estándar y

(iii) datos en bruto estándar de EM (espectrometría de masas) a partir de la célula estándar,

(b) someter la muestra de la al menos una célula de muestra a un análisis por EM para obtener los datos de muestra en bruto de la EM de la misma,

(c) someter los datos de la EM en bruto del estándar y en bruto de la muestra a al menos un primer

procedimiento de procesado de la señal de la EM para obtener unos perfiles de la EM pretratados del estándar y 15 de la muestra, y

(d) someter los datos de la productividad específica celular, de recuento integral de células viables o de concentración del producto celular procedentes de la célula estándar de la etapa (a) y los perfiles de la EM pretratados de la muestra y del estándar obtenidos en la etapa (c) a un segundo procedimiento de procesado de la señal de la EM que incluye un PLS - DA (un análisis discriminatorio por mínimos cuadrados parciales) basado en la evaluación comparativa, para predecir los datos de productividad específica celular, de recuento integral de células viables o de concentración del producto celular de la al menos una célula de muestra.

2. El proceso según la reivindicación 1, en el que la célula se elige de entre el grupo que consiste en líneas celulares humanas, líneas celulares animales, líneas celulares vegetales, células de hongos, células de bacterias, células de 25 levadura y células madre.

3. El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la célula es una línea celular CHO.

4. El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el análisis por EM de la etapa (b) es MALDI -TOF.

5. El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra de las células de muestra sometida a la etapa (b) comprende entre 0, 015 x 106 y 0, 0625 x 106 células.

6. El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la señal de los datos de la EM en bruto de la muestra obtenidos en la etapa (b) y los datos de la EM en bruto del estándar proporcionados en la etapa (a) se procesa mediante una operación elegida de entre el grupo que consiste en corrección de la línea de base, normalización, alineación, filtrado y recorte.

7. El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que los perfiles de la EM pretratados del estándar y de la muestra obtenidos en la etapa (c) son analizados ópticamente.

8. El proceso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la célula de muestra, con los datos predichos de productividad específica celular, de recuento integral de células viables o de concentración del

producto celular evaluados en la etapa (d) se cultiva en un cultivo celular para verificar sus datos de productividad específica celular, de recuento integral de células viables o de concentración del producto celular.

9. El proceso según la reivindicación 8, en el que los perfiles en bruto de la EM de la muestra obtenidos en la etapa (b) y los datos verificados de productividad específica celular, de recuento integral de células viables o de concentración del producto celular de la célula de muestra, se usan en la etapa (a) como datos estándar de la EM y como datos de productividad específica celular, de recuento integral de células viables o de concentración del producto celular a partir de una célula estándar.

10. Un proceso in vitro para el aislamiento de una célula con unos datos deseados de productividad específica 55 celular, de recuento integral de células viables o de concentración del producto celular, en el que se realiza un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y se aísla la célula deseada.

11. Un dispositivo adaptado para proporcionar una predicción de los datos de productividad específica celular, de recuento integral de células viables o de concentración del producto celular de al menos una célula de muestra en una etapa tardía de la amplificación, en particular, en biorreactores de gran volumen, cuando al dispositivo se le suministra una muestra de al menos una célula de muestra cultivada en un medio con un bajo volumen que comprende:

(a) un medio adaptado para someter una muestra de la al menos una célula de muestra a un análisis por EM 65 (espectrometría de masas) para obtener unos datos en bruto de la EM de la muestra de la misma,

(b) un medio adaptado para someter los datos de la EM en bruto de un estándar y en bruto de la muestra a al

menos un primer procedimiento de procesado de la señal de la EM para obtener unos perfiles de la EM pretratados del estándar y de la muestra, y

(c) un medio adaptado para someter los datos deproductividad específica celular, de recuento integral de células viables o de concentración del producto celular a partir de una célula estándar y los perfiles de la EM pretratados de la muestra y del estándar, a un segundo procedimiento de procesado de la señal de la EM que incluye un PLS

- DA (un análisis discriminatorio por mínimos cuadrados parciales) basado en la evaluación comparativa, para predecir los datos de productividad específica celular, de recuento integral de células viables o de concentración del producto celular de la célula de muestra.