Método y sistema para purificación de polipéptidos.

Un método basado en cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) para purificar un polipéptido que comprende las siguientes etapas:

a) aplicar una solución líquida que contiene el polipéptido a un medio cromatográfico que contiene una fase estacionaria;

b) separar el polipéptido de otras moléculas contenidas en la solución líquida haciendo pasar la solución líquida a través de la fase estacionaria del medio cromatográfico;

c) recuperar el polipéptido del medio cromatográfico en un flujo pasante o un eluato; y

d) esterilizar el flujo pasante o el eluato que contienen el polipéptido recuperado por filtración al vacío;

en el que dicha filtración estéril es filtración estéril en línea que se realiza directamente después de la cromatografía.

Método y sistema para purificación de polipéptidos

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un método y sistema automatizado para la purificación de polipéptidos. En particular, la presente invención se refiere a un método basado en cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) y a un sistema automatizado respectivo útil para la purificación de polipéptidos a partir de mezclas complejas.

Antecedentes de la invención La cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) es una forma de cromatografía líquida que se usa ampliamente, tanto a nivel académico como industrial, para separar y/o purificar grandes cantidades de diversas biomoléculas 15 tales como proteínas y ADN de mezclas complejas. En la FPLC una mezcla que contiene componentes solubles, incluyendo la biomolécula de interés, se separa haciéndola pasar a través de una fase estacionaria con ayuda de un flujo líquido, separándose así los componentes individuales de la mezcla. Dependiendo del método de elución usado, los componentes contenidos en la mezcla migran con diferentes velocidades a través de la fase estacionaria o quedan retenidos por interacción con un ligando específico con la fase estacionaria, separándose de esta manera 20 unos de otros.

Debido a su diseño simple, se desarrollaron sistemas de FPLC automatizada. Los sistemas basados en FPLC automatizada los fabrican, entre otros, GE Healthcare, Chalfont St. Giles, Reino Unido, y se comercializan con el nombre comercial ÃKTAâ¢.

Kanini et al. (es decir, Journal of Membrane Science 315 (2008) 1 -10) se refiere al ensuciamiento reversible e irreversible de la membrana durante la microfiltración en línea de soluciones de proteínas concentradas. Este documento no se pronuncia sobre la esterilización de un flujo por filtración a vacío, en particular filtración a vacío estéril en línea realizada directamente después del módulo de cromatografía FPLC.

Aunque esto simplifica la purificación de las biomoléculas, los ciclos de purificación solo se pueden configurar para ejecutarlos en los sistemas basados en FPLC actuales, donde el flujo pasante o eluato producido que contiene la biomolécula de interés puede recogerse en un corto tiempo una vez que ha salido del sistema. Cuando el flujo pasante o eluato producido no se recoge rápidamente y, por tanto, se deja expuesto durante un periodo más largo, el riesgo de deterioro aumenta. Una vez deteriorado el flujo pasante o eluato la biomolécula contenida ya no es de utilidad y debe desecharse o, como alternativa, descontaminarse extensivamente, lo que consume tiempo y es costoso. De esta manera, debe evitarse el deterioro del flujo pasante o eluato. Evitar el deterioro del flujo pasante o eluato actualmente requiere la asistencia del personal operativo en el momento en el que el flujo pasante o eluato sale del sistema lo que aumenta, en particular para ciclos de larga duración, la cantidad de horas-hombre adicionales sin aumento de la productividad. En consecuencia, la ejecución de los ciclos de purificación se ajusta de manera que el tiempo durante el cual el flujo pasante o eluato sale del sistema esté dentro de las horas de trabajo normales del personal operativo, lo que a su vez restringe el tiempo y el número de ciclos de purificación que se pueden ejecutar.

Breve descripción de la invención

Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proporcionar un medio para superar ciertas desventajas de los sistemas basados en FPLC actuales. En particular, es un objetivo proporcionar un método y sistema con flexibilidad y/o productividad mejoradas.

De acuerdo con la presente invención, este objetivo se consigue mediante la materia objeto de los siguientes puntos 1 a 14:

1. Un método basado en cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) para purificar un polipéptido, que 55 comprende las siguientes etapas:

a) aplicar una solución líquida que contiene el polipéptido a un medio cromatográfico que contiene una fase estacionaria; b) separar el polipéptido de otras moléculas contenidas en la solución líquida haciendo pasar la solución 60 líquida a través de la fase estacionaria del medio cromatográfico; c) recuperar el polipéptido del medio cromatográfico en un flujo pasante y/o eluato; d) esterilizar el flujo pasante o eluato que contiene el polipéptido recuperado por filtración al vacío;

en el que dicha filtración estéril es una filtración estéril en línea que se realiza directamente después de la 65 cromatografía.

2. El método de acuerdo con el punto 1, en el que en la etapa b) el polipéptido interactúa con y queda retenido por la fase estacionaria; y en la etapa c) el polipéptido se recupera por elución.

3. El método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 2, en el que una o más de las etapas a) a d) se 5 controlan automáticamente.

4. El método de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1 a 3, en el que la fase estacionaria es un biopolímero, polímero inorgánico o polímero sintético, cada uno de los cuales puede tener opcionalmente grupos funcionales acoplados al mismo, o es una membrana o un monolito.

5. Un sistema de cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) configurado para purificar un polipéptido de acuerdo con el método de uno cualquiera de los puntos 1 a 4, que comprende i) un módulo de cromatografía; y ii) un módulo de filtración dispuesto después del módulo de cromatografía, en el que el módulo de filtración comprende al menos un medio de filtración para filtración estéril de un flujo pasante o un eluato que contiene el polipéptido recuperado del módulo de cromatografía, y un medio de control para controlar la filtración estéril mediante al menos un medio de filtración, y en que la filtración estéril se realiza aplicando un vacío y en el que dicha filtración estéril es filtración estéril en línea que se realiza directamente después de la cromatografía.

6. El sistema de acuerdo con el punto 5, en el que el módulo de filtración comprende más de un medio de filtración para filtración estéril de un flujo pasante o un eluato que contiene el polipéptido recuperado del módulo de cromatografía y, para cada medio de filtración, un medio de control conectado funcionalmente para controlar la filtración estéril por el medio de filtración.

7. El sistema de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 5-6, en el que el medio de control comprende al menos un relé accionado eléctricamente, que comprende opcionalmente un terminal de entrada y un terminal de salida para controlar mediante un medio de cálculo y al menos una válvula electromecánica, ambos conectados funcionalmente.

8. El sistema de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 5-7, en el que cada medio de control comprende un 30 relé accionado eléctricamente y una válvula electromecánica, ambos conectados funcionalmente.

9. El sistema de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 5-8, en el que el medio de control comprende un terminal de entrada y un terminal de salida para controlar mediante un medio de cálculo.

10. El sistema de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 8-9, en el que la válvula electromecánica se usa para controlar la distribución de suministro de vacío al medio de filtración.

11. El sistema de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 8-10, en el que la válvula electromecánica se controla mediante el relé accionado eléctricamente. 40

12. El sistema de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 8-11, en el que la válvula electromecánica es una válvula de solenoide.

13. El sistema de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 5-12, en el que el medio de filtración es una copa 45 filtrante.

14. El sistema de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 5-13, en el que la filtración comprende cuatro filtraciones y cuatro medios de control.

Esterilizar directamente el flujo pasante o eluato una vez que ha salido del medio cromatográfico, tal como una columna de purificación, permite que este y la biomolécula contenida en su interior se almacenen de forma segura durante un periodo más largo sin riesgo de deterioro (es decir, usando filtración estéril en línea realizada directamente después de la cromatografía) . De esta manera, la solicitud se dirige preferentemente a un dispositivo que comprende un módulo de cromatografía y, posteriormente, un número de medios de filtración paralelos (es 55 decir, "más de 1") . La ventaja de tal dispositivo es que el eluato formado después de pasar el módulo de cromatografía pasará a través de un número de medios de filtración paralelos, lo que permite filtrar un volumen mucho mayor de líquido en un tiempo... [Seguir leyendo]

1. Un método basado en cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) para purificar un polipéptido que comprende las siguientes etapas:

a) aplicar una solución líquida que contiene el polipéptido a un medio cromatográfico que contiene una fase estacionaria; b) separar el polipéptido de otras moléculas contenidas en la solución líquida haciendo pasar la solución líquida a través de la fase estacionaria del medio cromatográfico;

c) recuperar el polipéptido del medio cromatográfico en un flujo pasante o un eluato; y d) esterilizar el flujo pasante o el eluato que contienen el polipéptido recuperado por filtración al vacío;

en el que dicha filtración estéril es filtración estéril en línea que se realiza directamente después de la cromatografía.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que en la etapa b) el polipéptido interactúa con y queda retenido por la fase estacionaria; y en la etapa c) el polipéptido se recupera por elución.

3. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que una o más de las etapas a) a d)

se controlan automáticamente. 20

4. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la fase estacionaria es un biopolímero, un polímero inorgánico o un polímero sintético, cada uno de los cuales puede tener opcionalmente grupos funcionales acoplados al mismo, o es una membrana o monolito.

5. Un sistema automatizado de cromatografía líquida rápida de proteínas (FPLC) configurado para purificar un polipéptido de acuerdo con el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende i) un módulo de cromatografía; y ii) un módulo de filtración dispuesto después del módulo de cromatografía, en donde el módulo de filtración comprende al menos un medio de filtración para filtración estéril de un flujo pasante o de un eluato que contiene el polipéptido recuperado del módulo de cromatografía y un medio de control para controlar la filtración estéril mediante al menos un medio de filtración, y en donde el medio de filtración se acciona aplicando un vacío, y en donde dicha filtración estéril es filtración estéril en línea que se realiza directamente después de la cromatografía.

6. El sistema de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el módulo de filtración comprende más de un medio de filtración para filtración estéril de un flujo pasante o de un eluato que contienen el polipéptido recuperado del módulo de cromatografía y, para cada medio de filtración, un medio de control conectado funcionalmente para controlar la filtración estéril mediante el medio de filtración.

7. El sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5-6, en el que el medio de control comprende al menos un relé accionado eléctricamente, que opcionalmente comprende un terminal de entrada y un terminal de salida para control mediante un medio de cálculo, y al menos una válvula electromecánica, ambos conectados funcionalmente.

8. El sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5-7, en el que cada medio de control comprende un relé accionado eléctricamente y una válvula electromecánica, ambos conectados funcionalmente. 45

9. El sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5-8, en el que el medio de control comprende un terminal de entrada y un terminal de salida para control mediante un medio de cálculo.

10. El sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-9, en el que la válvula electromecánica se 50 usa para controlar la distribución del suministro de vacío al medio de filtración.

11. El sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-10, en el que la válvula electromecánica se controla mediante el relé accionado eléctricamente.

12. El sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 8-11, en el que la válvula electromecánica es una válvula de solenoide.

13. El sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5-12, en el que el medio de filtración es una copa filtrante. 60

14. El sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5-13, en el que la filtración comprende cuatro filtraciones y cuatro medios de control.