Vector de expresión de mamíferos con una secuencia señal secretora altamente eficaz.

Casete de expresión para la secreción de una proteína heteróloga a partir de una célula huésped de mamíferoque comprende un promotor,

funcionalmente unido a una secuencia de ADN que codifica para un péptido señal queestá unido en marco a una secuencia de ADN que codifica para una proteína heteróloga, en el que la secuencia deADN que codifica para el péptido señal se selecciona de SEQ ID No. 10 o una secuencia de ADN que codifica parauna secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID No. 9.

Vector de expresión de mamíferos con una secuencia señal secretora altamente eficaz

La presente invención se refiere a sistemas de expresión a base de células de mamíferos y a la expresión y secreción de proteínas recombinantes usando péptidos señal secretores. La presente invención también se refiere a un casete de expresión útil para la secreción de un gen heterólogo a partir de una célula de mamífero, en particular una célula CHO. La presente invención también se refiere a métodos de secreción de una proteína heteróloga a partir de células de mamíferos tales como células CHO y a métodos para la producción de proteínas recombinantes secretadas en células huésped de mamíferos.

Se producen polipéptidos recombinantes para aplicaciones médicas, de investigación y veterinarias tales como anticuerpos usando una amplia variedad de organismos modificados por ingeniería genética que incluyen células procariotas y eucariotas. Sin embargo, muchas de estas proteínas son glicoproteínas que requieren modificaciones postraduccionales. Por tanto, células huésped procariotas tales como células bacterianas no son adecuadas. Por este motivo, se desarrollaron otros sistemas de expresión de proteínas usando las células de eucariotas superiores, por ejemplo células de insectos o células de mamíferos. Sistemas de expresión virales pueden producir proteínas recombinantes tanto en insectos como en líneas celulares de ratón pero padecen varias desventajas graves, en particular que la purificación de proteínas recombinantes a partir de sistemas infectados con virus es muy problemática.

Existe un problema importante en la biotecnología en la producción y recuperación de polipéptidos recombinantes que no se secretan fácilmente tales como proteínas intracelulares o subunidades proteicas, a partir de organismos modificados por ingeniería genética. A menudo, estas proteínas intracelulares o subunidades proteicas pueden expresarse a niveles sólo moderados dentro de una célula y su purificación debe incluir en primer lugar etapas para lisar las células, seguido por varios procedimientos para aislar los polipéptidos deseados de las otras proteínas intracelulares.

Un enfoque para solucionar estos problemas es hacer que las proteínas recombinantes se secreten al espacio periplásmico o medio de cultivo. Siempre que sea posible, la secreción es la estrategia preferida puesto que permite una purificación fácil y eficaz a partir del medio extracelular. Además, la producción secretora de proteínas recombinantes tiene la ventaja de que puede evitarse la degradación proteolítica y que hay una mejor posibilidad de corregir el plegamiento de las proteínas. La secreción de proteínas satisfactoria requiere una translocación eficaz de la proteína a través del retículo endoplasmático o la membrana plasmática. Las proteínas que se secretan a partir de una célula a través de una membrana celular se producen generalmente dentro de la célula en forma de un precursor, denominada “preproteína”. Esta forma de “preproteína” incluye una secuencia peptídica adicional en el extremo amino terminal que se requiere para dirigir la cadena peptídica naciente al retículo endoplasmático para permitir su entrada en la ruta secretora. Esta secuencia peptídica adicional se denomina secuencia señal.

Sin embargo, se sabe que la secreción frecuentemente no funciona en el grado deseado, por ejemplo porque la secuencia señal nativa de la proteína recombinante a menudo no funciona bien en la célula huésped. Hasta la fecha, cada sistema de expresión necesita una adaptación específica para cumplir los requisitos de cada producto de proteína para garantizar un plegamiento, una actividad correctos y un rendimiento deseado. Aunque se han identificado muchas secuencias señal que podrían ser útiles para la secreción de proteínas recombinantes particulares, hay todavía una necesidad en la técnica de secuencias señal adicionales que puedan promover una secreción eficaz de proteínas recombinantes, en particular inmunoglobulinas, en células huésped de mamíferos.

Por tanto, el problema técnico que subyace a la presente invención es proporcionar un método para secretar eficazmente polipéptidos de secreción no competente, en particular cadenas de anticuerpos a partir de una célula huésped eucariota tal como una célula de ovario de hámster chino (CHO) .

La presente invención soluciona este problema técnico proporcionando un casete de expresión para la secreción de una proteína heteróloga a partir de una célula huésped de mamífero, en particular una célula CHO que comprende un promotor, funcionalmente unido a una secuencia de ADN que codifica para un péptido señal que está unido en marco a una secuencia de ADN que codifica para una proteína heteróloga, en el que la secuencia de ADN que codifica para el péptido señal se selecciona de SEQ ID No. 10 o una secuencia de ADN que codifica para una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID No. 9.

Los inventores de la presente invención encontraron que las secuencias señal empleadas en los casetes de expresión proporcionan un procesamiento apropiado y una secreción eficaz de secuencias polipeptídicas operativamente unidas en células huésped de mamíferos. Como examen inicial, se han sometido a prueba diecinueve secuencias señal diferentes que se derivaban de diferentes proteínas secretadas de diferentes especies con respecto a las células CHO usadas de manera rutinaria para la producción de proteínas recombinantes mediante lo cual sólo 5 de las mismas dieron como resultado una secreción mejorada de los polipéptidos sometidos a prueba. Por tanto, los experimentos demostraron que generalmente no puede predecirse si una secuencia señal de una especie será funcional en otra especie.

Una de las cinco secuencias señal, concretamente V19 (SEQ ID No. 9) , dio como resultado líneas celulares con un aumento particularmente fuerte en la concentración de anticuerpos media con respecto a líneas celulares control.

Por tanto, la presente invención se refiere a un casete de expresión para la secreción de una proteína heteróloga a partir de una célula huésped de mamífero que comprende un promotor, funcionalmente unido a una secuencia de ADN que codifica para un péptido señal que está unido en marco a una secuencia de ADN que codifica para una proteína heteróloga, en el que la secuencia de ADN que codifica para el péptido señal se selecciona de SEQ ID No. 10 o una secuencia de ADN que codifica para una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID No. 9

En el contexto de la presente invención, un “casete de expresión” está constituido por uno o más genes que van a expresarse y secuencias que controlan su expresión tales como una secuencia promotora/potenciadora, incluyendo cualquier combinación de elementos de control de la transcripción de actuación en cis. Las secuencias que controlan la expresión del gen, es decir, su transcripción y la traducción del producto de transcripción, se denominan comúnmente unidad reguladora. La mayoría de las partes de la unidad reguladora están ubicadas en el sentido de 5’ de la secuencia codificante del gen heterólogo y están operativamente unidas a la misma. El casete de expresión puede contener también una región no traducida en 3’ en el sentido de 3’ que comprende un sitio de poliadenilación. La unidad reguladora de la invención o bien está unida directamente al gen que va a expresarse, es decir, unidad de transcripción, o bien está separada del mismo por ADN intermedio tal como por ejemplo por la región no traducida en 5’ del gen heterólogo. Preferiblemente, el casete de expresión está flanqueado por uno o más sitios de restricción adecuados con el fin de permitir la inserción del casete de expresión en un vector y/o su escisión de un vector. Por tanto, el casete de expresión según la presente invención puede usarse para la construcción de un vector de expresión, en particular un vector de expresión de mamíferos.

En el contexto de la invención, los términos “secuencia codificante heteróloga”, “secuencia génica heteróloga”, “gen heterólogo”, “gen recombinante” o “gen de interés” se usan de manera intercambiable. Estos términos se refieren a una secuencia de ADN que codifica para un producto de proteína recombinante o heteróloga que se busca para expresarse en la célula de mamífero y recogerse en una alta cantidad. El producto del gen puede ser una proteína o un polipéptido, pero también un péptido. La secuencia génica heteróloga no está presente de manera natural en la célula... [Seguir leyendo]

1. Casete de expresión para la secreción de una proteína heteróloga a partir de una célula huésped de mamífero que comprende un promotor, funcionalmente unido a una secuencia de ADN que codifica para un péptido señal que está unido en marco a una secuencia de ADN que codifica para una proteína heteróloga, en el que la secuencia de ADN que codifica para el péptido señal se selecciona de SEQ ID No. 10 o una secuencia de ADN que codifica para una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID No. 9.

2. Vector de expresión de mamíferos que comprende un promotor, funcionalmente unido a una secuencia de ADN que codifica para un péptido señal que está unido en marco a una secuencia de ADN que codifica para una proteína heteróloga, en el que la secuencia de ADN que codifica para el péptido señal se selecciona de SEQ ID No. 10 o una secuencia de ADN que codifica para una secuencia de aminoácidos representada en SEQ ID No. 9.

3. Célula huésped de mamífero que contiene un vector de expresión de mamíferos según la reivindicación 2.

4. Célula huésped de mamífero según la reivindicación 3, siendo la célula una célula de ovario de hámster chino (CHO) .

5. Procedimiento para la producción de una proteína recombinante, que comprende las etapas de

a) transfectar una célula huésped de mamífero con un vector de expresión según la reivindicación 2

b) cultivar la célula huésped en condiciones apropiadas en un medio para permitir la propagación de la célula y la expresión de la proteína recombinante y la secreción de la proteína recombinante a partir de la célula huésped al medio c) recoger la proteína recombinante secretada del medio.

6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que la célula huésped de mamífero es una célula CHO.