Preparación de péptidos antigénicos contra el cáncer.

Una emulsión de agua-en-aceite que comprende como ingrediente eficaz un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos de Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID NO:

3) que induce CTL que reconoce el péptido WT1 de tipo salvaje de una manera restringida por HLA-A24; en donde la emulsión está en una forma de dosificación unitaria que comprende de 0,1 a 100 mg del péptido.

Preparación de péptidos antigénicos contra el cáncer Campo técnico

[1] La presente invención se refiere a formulaciones que comprenden un péptido antigénico contra el cáncer restringido por HLA-A24. Específicamente, se refiere a formulaciones en emulsión utilizadas como vacuna contra el cáncer para el tratamiento de diversos cánceres, y kits para la preparación de las formulaciones.

Técnica anterior

[2] Las inmunidades celulares, particularmente las células T citotóxicas (referidas como CTL en lo sucesivo), juegan un papel importante en la eliminación de células cancerosas o de células infectadas por virus de un organismo vivo. Las CTL reconocen un complejo formado entre un péptido antigénico derivado de una proteína antigénica contra el cáncer en una célula cancerosa (péptido antigénico contra el cáncer) y un antígeno de clase I del MHC (Complejo Mayor de Histocompatibilidad) (referido como antígeno HLA en el caso de humano), y con ello atacar y dañar las células cancerosas.

[3] Los ejemplos representativos de proteínas antigénicas contra el cáncer se enumeran en las Tablas descritas en Immunity, vol. 1: 281, 1999. Los ejemplos específicos incluyen antígenos melanosomales tales como una proteína específica de tejido melanocítico, gp1 (J. Exp. Med., 179: 15, 1994), MART-1 (Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 91: 3515, 1994), y tirosinasa (J. Exp. Med., 178: 489, 1993); así como marcadores de tumores, tales como HER2-neu (J. Exp. Med., 181: 219, 1995), CEA (J. Nati. Cáncer Inst., 87: 982, 1995) y PSA(J. Nati. Cáncer Inst., 89: 293, 1997) como proteínas antigénicas contra el cáncer distintas de las de los melanomas. Péptidos antigénicos contra el cáncer son péptidos que consisten en aproximadamente 8 a 11 residuos de aminoácidos, que se generan a través del procesamiento de las proteínas antigénicas contra el cáncer con proteasas intracelulares (Cur. Opin, Immunol., 5: 79, 1993; Cur. Opin, Immunol., 5: 719, 1993; Cell, 82: 13, 1995; Immunol. Rev., 146: 167, 1995). Los péptidos antigénicos contra el cáncer generados de este modo se unen a los antígenos de clase I del MHC (antígenos HLA) para formar complejos y, a continuación los complejos son presentados sobre las superficies celulares, y reconocidos por las CTL como se ha descrito anteriormente. En el desarrollo de productos médicos para la inmunoterapia del cáncer (vacunas contra el cáncer) basados en la rotura de células cancerosas por las CTL, es por lo tanto muy importante identificar un péptido antigénico contra el cáncer de la proteína antigénica contra el cáncer, que pueda inducir eficazmente las CTL.

[4] Existen multitud de subtipos de moléculas antigénicas de clase I del MHC, y la secuencia de aminoácidos de un péptido antigénico que puede unirse al respectivo subtipo obedece a cierta regla (motivo de unión) que corresponde a un tipo de moléculas antigénicas del MHC. En cuanto al motivo de unión para HLA-A2, por ejemplo, el aminoácido de la posición 2 es leucina, metionina o isoleucina, y el aminoácido en la posición 9 es valina, leucina, o isoleucina. En cuanto el motivo de unión para HLA-A24, el aminoácido de la posición 2 es tirosina, fenilalanina, metionina o triptófano, y el aminoácido de la posición 9 es fenilalanina, leucina, isoleucina, triptófano o metionina. Recientemente, cualquier secuencia peptídica que se espera que sea capaz de unirse a antígenos HLA, incluyendo los motivos como mostrados más arriba puede ser buscada en bases de datos (por ejemplo, soporte lógico BIMAS; http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hla_bind/ ). Por lo tanto, con el fin de identificar un péptido antigénico contra el cáncer que pueda inducir las CTL de la proteína antigénica contra el cáncer, se identifican en primer lugar las regiones de péptidos que consisten en aproximadamente 8 a 11 residuos de aminoácidos que coinciden con el motivo de unión o la secuencia peptídica esperada para un tipo de HLA previsto a partir de la secuencia de aminoácidos de la proteína antigénica contra el cáncer.

[5] Sin embargo, un péptido que ha sido identificado basándose en el motivo de unión o la secuencia peptídica esperada no necesariamente tiene una actividad inductora de las CTL. Puesto que un péptido antigénico contra el cáncer se genera mediante el procesamiento intracelular de una proteína antigénica contra el cáncer, un péptido que no ha sido generado a través de procesamiento no puede ser un péptido antigénico. Además, puesto que existen muchas proteínas antigénicas contra el cáncer originalmente en un organismo vivo, las CTL pueden ser tolerantes a tales antígenos contra el cáncer, incluso si un péptido que tiene el motivo de unión o la secuencia de unión esperada se genera intracelularmente como un péptido antigénico contra el cáncer. Aquellas muestran que, con el fin de identificar un péptido antigénico contra el cáncer que tiene una actividad inductora de las CTL, una predicción meramente basada en el motivo de unión o la secuencia peptídica esperada para un tipo de HLA previsto es insuficiente, y debe ser importante una evaluación in vivo para determinar una actividad para inducir las CTL.

[6] Se aisló un gen supresor de cáncer de Wilms WT1 (gen WT1) del cromosoma 11 p13 como uno de los genes causantes de cáncer de Wilms basándose en el análisis del síndrome WAGR que estaba complicado por los cánceres de Wilms, aniridia, anomalía urogenital, retraso mental, etc. (Nature, 343: 774, 199). El ADN genómico de WT1 tiene aproximadamente 5 Kb, y se compone de diez exones, de los cuales el ADNc tiene aproximadamente 3

kb. La secuencia de aminoácidos deducida a partir del ADNc es la mostrada en el SEQ ID NO: 1 (Cell, 6:59, 199). Se ha sugerido que el gen WT1 promueve el crecimiento de células de leucemia a partir de los hechos de que el gen WT1 está altamente expresado en la leucemia humana, y que el crecimiento celular de las células leucémicas es suprimido por el tratamiento con oligómeros antisentido de WT1 (Publicación de Patente Japonesa (Kokai) Núm. 14627/1997). Se ha demostrado a continuación que el gen WT1 es una nueva proteína antigénica contra el cáncer de leucemia y de cánceres sólidos (J. Immunol., 164: 1873-188, 2, J. Clin. Immunol., 2, 195- 22, 2,) a partir del hecho de que el gen WT1 está también altamente expresado en cánceres sólidos tales como cáncer gástrico, cáncer de colon, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer embrionario, cáncer de piel, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer uterino, cáncer cervical, y cáncer de ovario (Publicación de Patente Japonesa (Kokai) Núm. 14627/1997, Publicación de patente japonesa (Kokai) Núm. 35484/1999). La inmunoterapia del cáncer (vacunas contra el cáncer) se puede aplicar preferiblemente a la mayor cantidad posible de pacientes de cáncer, y por lo tanto es importante identificar péptidos antigénicos contra el cáncer a partir de WT1, que está altamente expresado en muchos tipos de cánceres, y desarrollar vacunas contra el cáncer basadas en esos péptidos antigénicos contra el cáncer. En este contexto, los documentos WO/662 yWOOO/18795 describen péptidos antigénicos contra el cáncer de tipo natural compuestos de una porción de la proteína WT1, pero esos péptidos antigénicos contra el cáncer todavía no se han examinado para determinar su eficacia in vivo.

Descripción de la invención

[7]La presente invención pretende proporcionar péptidos antigénicos contra el cáncer derivados de WT1, que tienen eficacia in vivo, particularmente utilidad clínica, y vacunas contra el cáncer como formas de dosificación adecuadas para dichos péptidos antigénicos contra el cáncer.

[8JEI autor de la presente solicitud realizó el estudio clínico de los pacientes que habían dado su consentimiento informado con la aprobación de la Junta de Revisión Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Osaka, y encontró que la administración de algunos péptidos antigénicos contra el cáncer en una forma de dosificación particular a pacientes con cáncer aminora eficientemente sus condiciones patológicas, completando así la presente invención.

[9]De este modo, la presente invención se refiere a:

(1) una emulsión de agua-en-aceite que comprende como un ingrediente eficaz un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos de Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID NO: 3) que induce CTL que reconoce el péptido WT1 de tipo salvaje de manera restringida por FILA- A24, en donde la emulsión está en una forma de dosificación unitaria que comprende de ,1 a 1 mg del péptido;

(2) un procedimiento para la preparación de la emulsión de agua en aceite de acuerdo con la invención, que comprende mezclar una preparación que comprende... [Seguir leyendo]

1. Una emulsión de agua-en-aceite que comprende como ingrediente eficaz un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos de Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID NO: 3) que induce CTL que reconoce el péptido WT1

de tipo salvaje de una manera restringida por HLA-A24; en donde la emulsión está en una forma de dosificación unitaria que comprende de ,1 a 1 mg del péptido.

2. La emulsión de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la emulsión se va a utilizar como una vacuna contra el cáncer.

3. Un procedimiento para la preparación de la emulsión de agua-en-aceite de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que comprende mezclar una preparación que comprende un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos de Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID NO: 3) que induce CTL que reconoce el péptido WT1 de tipo salvaje de una manera restringida por HLA-A24, junto con un emulsionante y un aceite.

4. Un kit para la preparación de la emulsión de agua-en-aceite de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, que incluye un recipiente que comprende un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos de Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID NO: 3) que induce CTL que reconoce el péptido WT1 tipo salvaje de una manera restringida por HLA- A24, y un recipiente que comprende un emulsionante y un aceite.

5. El kit de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el kit se va a utilizar para preparar la emulsión de agua en aceite de acuerdo con la reivindicación 1 justo antes del uso.

6. El uso de la emulsión de agua en aceite de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 para la preparación de una 25 composición farmacéutica para el tratamiento de un paciente de cáncer que es positivo para un HLA-A24 y positivo

para WT1.