Método para diagnosticar el cáncer que comprende la medición de las células precursoras de CTL específicos de WT1.

Un método in vitro para diagnosticar el cáncer, que comprende las siguientes etapas (a) y (b):

(a) medir la frecuencia de la existencia o la cantidad de células precursoras de CTL específicos de WT1 en unamuestra biológica que contiene células precursoras de CTL de un sujeto de ensayo; y

(b) decidir el valor de (a) medido es o no elevado en comparación con el de un sujeto sano, y evaluar el sujetode ensayo como un paciente que tiene cáncer cuando el valor medido de (a) es 1,5 veces o mayor que el de unsujeto sano,en donde la medición de la frecuencia de la existencia o la cantidad de células precursoras de CTL específico deWT1 específico se lleva a cabo por medio de uno cualquiera del método del monómero HLA, el método del dímerode HLA, el método del tetrámero de HLA y el método del pentámero HLA.

Método para diagnosticar el cáncer que comprende la medición de las células precursoras de CTL específicos de WT1

Campo técnico [0001] La invención se refiere a un método in vitro para diagnosticar el cáncer basándose en la frecuencia de las células precursoras de CTL específicos de WT1. La descripción se refiere generalmente a un método de selección de pacientes altamente sensibles a la vacuna de WT1 y un método terapéutico para el seguimiento del cáncer que implica dicho método de selección. Más concretamente, se describe en la presente memoria un método de selección de pacientes altamente sensibles a la vacuna de WT1 basándose en la frecuencia de precursores de CTL específicos de WT1 como indicador, y similares.

Técnica anterior

El gen WT1 (gen de tumor de Wilms 1) se ha identificado como uno de los genes causantes del tumor de Wilms que es un tumor renal de la infancia (Cell 60: 509, 1990, Nature 343: 774, 1990) . El gen WT1 codifica el factor de transcripción WT1 y WT1 desempeña un papel importante en muchos procesos tales como la proliferación, la diferenciación y la apoptosis de células y el desarrollo de tejidos (Int. Rev. Cytol. 181: 151, 1998) . El gen WT1 se definió originalmente como un gen supresor de tumores. Sin embargo, estudios posteriores revelaron que el gen WT1 está altamente expresado en la leucemia y diversos cánceres sólidos incluyendo el cáncer de pulmón y el cáncer de mama y por lo tanto, se indica que el gen WT1 ejerce una función oncogénica que promueve el crecimiento canceroso. Además, se demostró que la estimulación in vitro de células mononucleares de sangre periférica, siendo dichas células positivas para HLA-A*0201 o HLA-A*2402, con péptidos derivados de WT1 induce los linfocitos T citotóxicos específicos de péptido (CTL) y los CTL destruyen las células de leucemia o de tumor sólido que expresan de forma endógena WT1. Estos resultados demostraron que WT1 es una molécula diana prometedora para inmunoterapia de cáncer (Int. J. Hematol 76: 127, 2002) .

Ha habido métodos conocidos para determinar CTL específicos de péptido antigénico in vitro, incluyendo el método del monómero de HLA, el método del dímero de HLA y el método del tetrámero de HLA (Science 274: 94, 1996) , el método del pentámero de HLA y el método ELISPOT (J. Immunol. Methods 110:29, 1988) , la técnica de RT-PCR en tiempo real (J. Immunol. Methods 210:195, 1997) , el método de dilución limitante (Br. J. Cancer 77: 1907, 1998) y similares. El tetrámero de HLA se prepara por biotinilación de un complejo (monómero de HLA) formado por asociación de la cadena α de HLA y la β2microglobulina con un péptido, y permitiendo que el monómero se una a avidina marcada con fluorescencia para la tetramerización. Las frecuencias de los CTL se pueden medir tiñendo CTL específicos de péptido con tetrámeros de HLA y analizando por medio de citometría de flujo. La medición de las frecuencias de CTL por el método del monómero de HLA, el método del dímero de HLA y el método del pentámero de HLA se pueden llevar a cabo basándose en el mismo principio.

Los CTL no estimulados con vacuna se denominan "células precursoras de CTL". Se considera que cuanto mayor sea la frecuencia de la existencia de células precursoras de CTL específicas para un antígeno canceroso dado, más eficazmente pueden inducirse CTL específicos, cuando dicho antígeno se administra como una vacuna para el cáncer, que hace más fácil conseguir respuesta clínica de la terapia con la vacuna contra el cáncer. En otras palabras, si se selecciona un paciente que muestra alta frecuencia de existencia con respecto a las células precursoras de CTL específicas para un antígeno canceroso dado antes de la vacunación, sería posible tratarlo más eficazmente mediante el uso de dicho antígeno canceroso.

La frecuencia de células precursoras de CTL se midió utilizando el tetrámero de HLA y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con melanoma y se ha presentado en varios artículos; sin embargo, estos muestran que la frecuencia de células precursoras de CTL específicas para un péptido antigénico tumoral es baja (J. Immunother. 24: 66, 2001, Hum. Gene. Ther. 13: 569, 2002) . A partir de estos resultados, se ha considerado que la frecuencia de existencia de las células precursoras de CTL específicas para un antígeno es generalmente baja y que es difícil seleccionar pacientes adecuados para una vacuna contra el cáncer basándose en la frecuencia de células precursoras de CTL como indicador.

El documento WO 03037060 extrae de la técnica anterior que el gen WT1 es un buen marcador para el diagnóstico de la progresión de la enfermedad de cáncer y sugiere el uso de complejos tetrámeros que comprenden péptidos derivados de WT1 para la detección de células T específicas de WT1 y su uso en la detección temprana de los tumores malignos asociados con WT1 y para el control de la enfermedad residual mínima.

Maeda et al, 2002 (Brit J Cancer, 87, 796-804) describe un método para el tratamiento con una vacuna contra tumores que implica la detección de células precursoras de CTL específicas de péptidos en el estado de prevacunación. Los autores muestran que son detectables células precursoras de CTL específicas de péptido en la mayoría de los pacientes con cáncer, pero el porcentaje de estas células no implica automáticamente que la persona sometida a ensayo padezca cáncer.

Descripción de la invención En su sentido más amplio la presente invención se refiere a métodos como los definidos en las reivindicaciones. En la presente memoria se describe un método de selección de un paciente muy sensible a la vacuna de WT1 sobre la base de la frecuencia de las células precursoras de CTL específicos de WT1 como indicador, y similares.

Se preparó un tetrámero de HLA utilizando un péptido antigénico tumoral derivado de WT1, y se utilizó el tetrámero resultante en la medición de la frecuencia de las células precursoras de CTL en pacientes de tumores malignos hematopoyéticos o cáncer de pulmón antes de la administración de la vacuna. Se encontró que células precursoras de CTL (células precursoras de CTL específicos de WT1) existen con una frecuencia más alta que la que se conocía hasta ahora en comparación con individuos sanos. Este resultado reveló que es posible seleccionar pacientes altamente sensibles a la vacuna de WT1 o identificar una molécula diana de la vacuna de WT1 sobre la base de la frecuencia de las células precursoras de CTL específicos de WT1 como indicador, en la medida en la que se refiera antígeno tumoral WT1. También, ya que los pacientes que tienen diversos tipos de cáncer mostraron una alta frecuencia de células precursoras de CTL específicos de WT1, se hizo evidente que el diagnóstico del cáncer puede realizarse sobre la base de la frecuencia de las células precursoras de CTL específicos de WT1 como indicador.

A continuación las células precursoras de CTL específicos de WT1 se clasificaron detalladamente con respecto a su función, y se encontró que, en particular, la célula precursora de CTL de tipo efector de (en adelante, puede ser referida simplemente como "célula efectora") existe en mayor proporción entre las células precursoras de CTL. Este resultado indicó que la selección de pacientes altamente sensibles a la vacuna de WT1 o el diagnóstico de cáncer también se puede llevar a cabo sobre la base de la frecuencia de las células precursoras de CTL específicos de WT1 de tipo efector como indicador.

Además, se midió la frecuencia de CTL específicos de WT1 en pacientes sometidos a tratamiento con un péptido antigénico tumoral ("péptido WT1") derivado de WT1 y se encontró que el efecto terapéutico se correlacionaba con el aumento de la frecuencia de CTL después de la administración con respecto a la obtenida antes de la administración.

La presente invención se ha establecido sobre la base de las conclusiones anteriores.

Por lo tanto, la presente invención proporciona lo siguiente:

(1) Un método in vitro de diagnóstico del cáncer, que comprende las siguientes etapas (a) y (b) :

(a) medir la frecuencia de existencia o la cantidad de células precursoras de CTL específicos de WT1 en una muestra biológica que contiene células precursoras de CTL de un sujeto de ensayo (a) ; y

(b) decidir si el valor medido de (a) es o no elevado en comparación con el de un sujeto sano, y evaluar el sujeto de ensayo como un paciente que tiene cáncer cuando el valor medido de (a) es 1, 5 veces o mayor el de un sujeto sano,

en donde la medición de la frecuencia de existencia o la cantidad de células precursoras de CTL... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para diagnosticar el cáncer, que comprende las siguientes etapas (a) y (b) :

(a) medir la frecuencia de la existencia o la cantidad de células precursoras de CTL específicos de WT1 en una muestra biológica que contiene células precursoras de CTL de un sujeto de ensayo; y

(b) decidir el valor de (a) medido es o no elevado en comparación con el de un sujeto sano, y evaluar el sujeto de ensayo como un paciente que tiene cáncer cuando el valor medido de (a) es 1, 5 veces o mayor que el de un sujeto sano,

en donde la medición de la frecuencia de la existencia o la cantidad de células precursoras de CTL específico de WT1 específico se lleva a cabo por medio de uno cualquiera del método del monómero HLA, el método del dímero de HLA, el método del tetrámero de HLA y el método del pentámero HLA.

2. El método de diagnóstico de cáncer de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la medición se lleva a cabo por medio del método de tetrámero de HLA.

3. El método de diagnóstico del cáncer de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la etapa (b) de la reivindicación 1 se lleva a cabo mediante la medición de la proporción de células unidas al tetrámero de HLA entre los CTL positivos para CD8 o positivos para CD8/CD3.

4. El método de diagnóstico del cáncer de acuerdo con la reivindicación 3, en donde el antígeno HLA como componente del tetrámero de HLA es un antígeno HLA-A24 o un antígeno HLA-A2.

5. El método de diagnóstico de cáncer de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que se lleva a cabo utilizando la citometría de flujo.

6. El método de diagnóstico de cáncer de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el antígeno HLA como componente de un monómero de HLA, un dímero de HLA, un tetrámero de HLA o un pentámero de HLA es un antígeno HLA-A24.