Método de selección de pacientes candidatos para la vacuna contra WT1.

Un método in vitro para determinar la idoneidad de un paciente para la vacuna contra WT1,

que comprende las siguientes etapas (a) y (b):

(a) medir la frecuencia de existencia o la cantidad de los CTL específicos de WT1 en una muestra biológica que contiene los CTL de un paciente después de la administración de la vacuna contra WT1; y

(b) decidir si el valor medido de (a) es alto o no en comparación con el de la muestra biológica obtenida antes de la administración de la vacuna contra WT1, y considerar que el paciente es idóneo para la vacuna contra WT1 cuando el valor medido de (a) es 1,5 veces o mayor en comparación con que en la muestra obtenida antes de la administración

Método de selección de pacientes candidatos para la vacuna contra WT1

Campo técnico La presente invención se refiere a un método de selección de pacientes altamente sensibles a la vacuna contra WT1. Más concretamente, la presente invención se refiere a un método de selección de pacientes altamente sensibles a la vacuna contra WT1 sobre la base de la frecuencia de precursores de CTL específicos de WT1 como indicador, y similares.

Técnica anterior

El gen WT1 (gen del tumor de Wilms 1) se ha identificado como uno de los genes causantes del tumor de Wilms que es un tumor renal infantil (Cell 60: 509, 1990, Nature 343: 774, 1990) . El gen WT1 codifica el factor de transcripción WT1, y WT1 desempeña un papel importante en muchos procesos tales como la proliferación, la diferenciación y la apoptosis de las células, y el desarrollo de los tejidos (Int. Rev. Cytol.181: 151, 1998) . El gen WT1 fue definido originalmente como un gen supresor de tumores. Sin embargo, estudios posteriores revelaron que el gen WT1 está altamente expresado en la leucemia y varios cánceres sólidos, incluyendo cáncer de pulmón y cáncer de mama, e indicando, de ese modo, que el gen WT1 ejerce más bien una función oncogénica que promueve el crecimiento del cáncer. Además, se demostró que la estimulación in vitro de células mononucleares de sangre periférica, células que son positivas para HLA-A*0201 o HLA-A*2402, con péptidos derivados de WT1 induce la formación de los linfocitos T citotóxicos específicos de péptido (CTL) , y los CTL destruyen las células de leucemia o de tumores sólidos que expresan endógenamente WT1. Estos resultados demostraron que WT1 es una molécula diana prometedora en la inmunoterapia del cáncer (Int. J. Hematol 76: 127, 2002) .

Se conocen métodos para la determinación de CTL específicos de péptidos antigénicos in vitro, incluyendo el método del monómero de HLA, el método del dímero HLA y el método del tetrámero de HLA (Science 274: 94, 1996) , el método del pentámero de HLA y el método ELISPOT (J. Immunol. Methods 110: 29, 1988) , la técnica de RT-PCR en tiempo real (J. Immunol. Methods 210: 195, 1997) , el método de dilución limitante (Br. J. Cancer 77: 1907, 1998) , y similares. El tetrámetro de HLA se prepara biotinilando un complejo (monómero de HLA) formado por asociación de la α-cadena de HLA y microglobulina β2 con un péptido, y permitiendo que el monómero se una a avidina marcada con fluorescencia para la tetramerización. Las frecuencias de los CTL se pueden medir por tinción de CTL específicos del péptido con tetrámeros de HLA y análisis mediante citometría de flujo. La medición de frecuencias de CTL por el método del monómero de HLA, el método del dímero de HLA y el método del pentámero de HLA se puede llevar a cabo basándose en el mismo principio.

Los CTL no estimulados con vacunas se conocen como "células precursoras de CTL". Se considera que cuanto mayor es la frecuencia de existencia de células precursoras de CTL específicas para un antígeno canceroso dado, más eficazmente se pueden inducir los CTL específicos, cuando dicho antígeno se administra como una vacuna contra el cáncer, que hace que sea más fácil alcanzar la respuesta clínica de la terapia de vacuna contra el cáncer. En otras palabras, si se selecciona un paciente que muestra una alta frecuencia de existencia en relación con las células precursoras de CTL específicas para un antígeno canceroso dado antes de la vacunación, sería posible un tratamiento más eficazmente mediante el uso de dicho antígeno canceroso.

La frecuencia de las células precursoras de CTL se midió utilizando tetrámeros de HLA y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de pacientes con melanoma y se refirió en varios publicaciones; sin embargo, éstas muestran que la frecuencia de las células precursoras de CTL específicas para el péptido antigénico tumoral es baja (J. Immunother. 24: 66, 2001 Hum. Gene. Ther.13: 569, 2002) . A partir de estos resultados, se ha considerado que la frecuencia de existencia de células precursoras de CTL específicas para el antígeno es generalmente baja y que es difícil seleccionar los pacientes adecuados para una vacuna contra el cáncer sobre la base de la frecuencia de células precursoras de CTL como indicador.

Tsuboi et al., 2002 (Cancer Immunol Immunother. 51, 614-620) describen un epítopo de unión a HLA-A2 inmunogénico de WT1 y la inducción de CTL específicos después de la exposición al mismo.

Oka et al., 2002 (Curr Canc Drug Target, 2, 45-54) describen la generación de CTL específicos de WT1 y el rechazo de las células tumorales que expresan WT1 por medio de la vacunación contra WT1. Los autores también describen un péptido derivado de WT1 inmunogénico, esto es Db126.

Oka et al., 2000 (3 Immunol, 164, 1873-1880) describen la inducción de CTL específicos de WT1 en ratones después de la administración de péptidos WT1 y la posterior protección en estos ratones sensibilizaciones tumorales. Los autores llegaron a la conclusión de que los precursores de CTL responsables de los péptidos WT1 estaban presentes.

Borrello et al., 2002 (Cancer Control, 9 (2) , 138-150) revisan varios candidatos potenciales para el desarrollo de vacunas contra el cáncer, incluyendo WT1.

Maeda et al., 2002 (Brit J Cancer, 87, 796-804) describen un método para el tratamiento con vacunas tumorales que implica la detección de las células precursoras de CTL específicas del péptido en el estado previo a la vacunación. Los autores demuestran que las células precursoras de CTL específicas del péptido son detectables en la mayoría de los pacientes con cáncer, pero el porcentaje de estas células no implica automáticamente que la persona de ensayo padezca cáncer.

Descripción de la invención En su sentido más amplio, la presente invención se refiere a métodos tales como los que se definen en las reivindicaciones adjuntas.

El propósito de la presente invención es proporcionar un método de selección de un paciente muy sensible a la vacuna contra WT1 sobre la base de la frecuencia de las células precursoras de CTL específicas de WT1 como indicador, y similares.

El autor de la presente invención preparó un tetrámero de HLA utilizando un péptido antigénico tumoral derivado de WT1, y utilizó el tetrámero resultante en la medición de la frecuencia de células precursoras de CTL en los pacientes con una malignidad hematopoyética o con cáncer de pulmón antes de la administración de la vacuna. Se encontró sorprendentemente que existen células precursoras de CTL (células precursoras de CTL específicas de WT1) con una frecuencia mayor de la que se conocía hasta ahora en comparación con individuos sanos. Este resultado reveló que es posible seleccionar a los pacientes altamente sensibles a la vacuna contra WT1 o identificar una molécula diana de la vacuna contra WT1 sobre la base de la frecuencia de las células precursoras de CTL específicas de WT1 como un indicador, en lo que respecta a un antígeno tumoral WT1. Asimismo, puesto que los pacientes que tienen diversos tipos de cáncer mostraron una alta frecuencia de células precursoras de CTL específicas de WT1, se hizo evidente que el diagnóstico del cáncer se puede realizar sobre la base de la frecuencia de las células precursoras de CTL específicas de WT1 como un indicador.

El autor de la presente invención clasificó a continuación las células precursoras de CTL específicas de WT1 finamente con respecto a su función, y se encontró que, en particular, células precursoras de CTL de tipo efector (en adelante, pueden ser referidas simplemente como "células efectoras") existen en mayor proporción entre las células precursoras de CTL. Este resultado indicó que la selección de pacientes altamente sensibles a la vacuna contra WT1 o el diagnóstico de cáncer también se puede llevar a cabo sobre la base de la frecuencia de las células precursoras de CTL específicas de WT1 de tipo efector como indicador.

Además, el autor de la presente invención midió la frecuencia de CTL específicas de WT1 en pacientes sometidos a tratamiento con un péptido antigénico tumoral ("péptido WT1") derivado de WT1 y encontró que el efecto terapéutico se correlacionaba con el aumento de la frecuencia de CTL después de la administración en relación con el obtenido antes de la administración.

La presente invención se ha establecido sobre la base de las conclusiones anteriores.

Por lo tanto, la presente invención proporciona lo siguiente:

Un método in vitro para determinar la idoneidad de un paciente para la vacuna contra WT1, que comprende las siguientes etapas (a) y (b) :

(a)... [Seguir leyendo]

1. Un método in vitro para determinar la idoneidad de un paciente para la vacuna contra WT1, que comprende las siguientes etapas (a) y (b) :

(a) medir la frecuencia de existencia o la cantidad de los CTL específicos de WT1 en una muestra biológica que contiene los CTL de un paciente después de la administración de la vacuna contra WT1; y

(b) decidir si el valor medido de (a) es alto o no en comparación con el de la muestra biológica obtenida antes de la administración de la vacuna contra WT1, y considerar que el paciente es idóneo para la vacuna contra WT1 cuando el valor medido de (a) es 1, 5 veces o mayor en comparación con que en la muestra obtenida antes de la administración.

2. El método de determinación de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la medición de la frecuencia de existencia o la cantidad de los CTL específicos de WT1 se lleva a cabo por medio de uno cualquiera de método del monómero de HLA, el método del dímero de HLA, el método del tetrámero de HLA, el método del pentámero de HLA, el método ELISPOT, la técnica de RT-PCR en tiempo real y el método de dilución limitante.

3. El método de determinación de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la medición se lleva a cabo por medio del método del tetrámero de HLA.

4. El método de determinación de acuerdo con la reivindicación 3, que comprende las siguientes etapas (a) , (b) y (c) :

(a) poner un tetrámero de HLA que comprende un péptido antigénico tumoral derivado de WT1 en contacto con una muestra biológica que contiene los CTL de un paciente después de la administración de la vacuna contra WT1;

(b) medir de la frecuencia de existencia o la cantidad de los CTL específicos de WT1 unidos al tetrámero de 25 HLA; y

(c) decidir si el valor medido de (b) es alto o no en comparación con el de la muestra biológica obtenida antes de la administración de la vacuna contra WT1 y decidir que el paciente es idóneo para la vacuna contra WT1 cuando el valor medido en (b) es 1, 5 veces o mayor que el de antes de la administración de la vacuna contra WT1.

5. El método de determinación de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la etapa (b) en la reivindicación 4 se lleva a cabo midiendo la proporción de células unidas al tetrámero de HLA entre los CTL positivos para CD8 o positivos para CD8/CD3.

6. El método de determinación de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, en donde el antígeno HLA como componente de tetrámero de HLA es un antígeno HLA-A24 o un antígeno HLA-A2.

7. El método de determinación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, en donde el péptido antigénico tumoral derivado de WT1 se selecciona entre los siguientes péptidos:

Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID NO: 2) , Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID NO: 3) , Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 4) y Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (SEQ ID NO: 5) .

8. El método de determinación de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que se lleva a cabo utilizando citometría de flujo.

9. El uso de un kit que comprende un agente de diagnóstico clínico para determinar la idoneidad de un paciente para la vacuna contra WT1 de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8", que comprende como 50 ingrediente un monómero de HLA, un dímero de HLA, un tetrámero de HLA o un pentámero de HLA que contienen cada uno un péptido antigénico tumoral derivado de WT1 y estreptavidina marcada con fluorescencia, anticuerpo monoclonal anti-CD8 humano de ratón marcado con fluorescencia, anticuerpo monoclonal anti-CD3 humano de ratón marcado con fluorescencia, anticuerpo monoclonal anti-CD45RA humano de ratón marcado con fluorescencia o anticuerpo monoclonal anti CD27-humano de ratón marcado con fluorescencia. 55

10. El uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el antígeno HLA como componente de un monómero de HLA, un dímero de HLA, un tetrámero de HLA o un pentámero de HLA es un antígeno HLA-A24 o un antígeno HLA-A2.

11. El uso de acuerdo con la reivindicación 9 o la reivindicación 10, en donde el péptido antigénico tumoral derivado de WT1 se selecciona entre los siguientes péptidos: Cys Met Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID NO: 2) , Cys Tyr Thr Trp Asn Gln Met Asn Leu (SEQ ID NO: 3) , Arg Met Phe Pro Asn Ala Pro Tyr Leu (SEQ ID NO: 4) y

Arg Tyr Pro Ser Cys Gln Lys Lys Phe (SEQ ID NO: 5) .