Polipéptido quimérico fibrina-filagrina citrulinado capaz de detectar los anticuerpos generados en la artritis reumatoide.

La presente invención se refiere a un polipéptido quimérico, capaz de detectar los anticuerpos generados en la artritis reumatoide,

que comprende al menos dos subunidades peptídicas citrulinadas:(i) una procedente de la cadena a o ß de la fibrina y (ii) una segunda procedente de la filagrina. Además, la invención comprendeuna composición antigénica, un método y un kit para el diagnóstico de la artritis reumatoide, a partir de la detección de los auto- anticuerpos generados durante el curso de dicha enfermedad.

Polipéptido quimérico fibrina-filagrina citrulinado capaz de detectar los anticuerpos generados en la artritis reumatoide

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un polipéptido quimérico, capaz de detectar los anticuerpos generados en la artritis reumatoide, que comprende al menos dos subunidades peptídicas citrulinadas: (i) una procedente de la cadena a o (3 de la fibrina y (ii) una segunda procedente de la filagrina. Además, la invención comprende una composición antigénica, un método y un kit para el diagnóstico y pronóstico de la artritis reumatoide, a partir de la detección de los auto-anticuerpos generados durante el curso de dicha enfermedad.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La artritis reumatoide (AR) es una de las enfermedades autoinmunes más comunes, con un origen desconocido y que afecta al.5-1% de la población, destruyendo progresivamente las articulaciones, causándoles deformidad y pérdida de función, además de producir complicaciones sistémicas.

En esta enfermedad la terapia intensiva aplicada en estadios iniciales ofrece resultados muy positivos, siendo fundamental su diagnóstico prematuro. El criterio de clasificación para la AR según el Colegio Americano de Reumatología (ACR) (Arnelt FC, et al. Arthritis Rheum. 1988; 31:315-24) está basado en parámetros puramente clínicos, aunque estos criterios no son útiles para el diagnóstico temprano de la AR (Saraux A, et al. Arthritis Rheum 21; 44: 2485-91).

En la actualidad existen diferentes métodos serológicos que permiten el diagnóstico de la AR y la distinguen de otras patologías similares en fases tempranas de su evolución. En este sentido, se conocen una serie de anticuerpos específicos para la AR, tales como: el factor antiperinuclear (APF), anticuerpos antifilagrina (AFA) y los anticuerpos antiqueratina (AKA). Los epítopos reconocidos por estos anticuerpos (auto-anticuerpos anti-proteínas citrulinadas) son generados por modificaciones post-traduccionales que consisten en la deiminación de la arginina a citrulina por la enzima peptidilarginina deiminasa (Vossenaar ER, etal. Bioessays 23; 25:116-18).

Una de las herramientas más específicas en el diagnóstico de la AR consiste en la detección de los auto-anticuerpos generados frente a péptidos o proteínas citrulinadas, constituyendo éstos uno de los marcadores serológicos más eficaces de esta patología que se conocen (Nijenhuis S, et al. Clin. Chim. Acta 24; 35: 17-34). Incluso, los kits (ELISA) más efectivos y comercialmente más extendidos para el diagnóstico de la AR están basados en péptidos citrulinados (CCP-1 y CCP-2) derivados concretamente de la proteína filagrina (Nijenhuis S, et al. 24).

Otras proteínas del tejido sinovial que pueden ser citrulinadas son las cadenas a y (3 de la fibrina y el antígeno Sa o vimentina citrulinada. Recientemente, Sebbag et al (Sebbag et al Eur. J. Clin. Immunol. 26, 36: 225-2263) identificó 18 péptidos derivados de la proteina fibrina, dos de los cuales, denominados como [Cit6,72,74] (3-fibrina (6- 74) y [Cit38,42] a-fibrina (36-5) y localizados en el dominio globular de la proteína, eran capaces de reaccionar frente a todos los sueros positivos para auto-anticuerpos anti-proteínas citrulinadas. Estos resultados han sido corroborados por recientes estudios (Pérez, et al Chem. Biol. Drug Des. 26, 68, 194-2; US 7,22,485), donde se ha analizado la reactividad de péptidos derivados de la fibrina en el diagnóstico de AR, confirmándose así su utilidad para el desarrollo y mejora de la eficacia de los sistemas de diagnóstico actuales.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

Existe un creciente interés por desarrollar tests o pruebas específicas que mejoren el diagnóstico de la AR así como su diferenciación temprana respecto a otras enfermedades reumáticas que afectan a las articulaciones y tejido conectivo, sobre todo en pacientes con un peor pronóstico o aquellos con un desarrollo más temprano de la enfermedad. La incorporación de estos tests en la práctica clínica podría permitir la identificación de aquellos pacientes que requieren terapias más intensivas desde el mismo momento del diagnóstico de la enfermedad, permitiendo así un mayor control de ésta y, consecuentemente evitar al máximo la destrucción articular y mejorar el pronóstico de la enfermedad.

Los autores de la presente invención, en su afán de mejorar los sistemas de diagnóstico de la AR que se emplean actualmente, han descubierto sorprendentemente una serie de péptidos citrulinados de las cadenas a y (3 de la fibrina con especial sensibilidad y especificidad frente a los auto-anticuerpos anti-proteínas citrulinadas, en adelante auto-anticuerpos, que se generan durante el desarrollo de la AR. Además, uno de estos péptidos citrulinados de la cadena a de la fibrina fue unido covalentemente a un péptido cíclico de la filagrina obteniéndose un polipéptido quimérico (fibrina-filagrina) que fue capaz de complementar o mejorar los resultados de sensibilidad y especificidad obtenidos con péptidos CCP-1 y CCP-2 (Inmunoscan RA).

Así, un primer aspecto de la invención está referido a un polipéptido quimérico, que comprende al menos dos subunidades peptídicas citrulinadas y unidas covalentemente, capaz de interaccionar con anticuerpos auto-inmunes citrulinados generados durante la AR, donde:

a. una subunidad (a) comprende al menos un 85% de homología, preferentemente al menos un 9%, más preferentemente al menos un 93%, aún más preferentemente al menos un 95% y todavía más preferentemente al menos un 98%, con un fragmento de al menos 7 aminoácidos de cualquiera de las cadenas a y (3 de la fibrina, preferentemente de longitud entre 1 y 18 aminoácidos, y

b. una segunda subunidad (b) ciclada que comprende al menos un 85%, preferentemente al menos un 9%, más preferentemente al menos un 93%, aún más preferentemente al menos un 95% y todavía más preferentemente al menos un 98%, de homología con un fragmento de al menos 7 aminoácidos de la proteína filagrina, preferentemente de longitud entre 1 y 18 aminoácidos.

En una realización preferida de este aspecto de la invención la subunldad b comprende al menos dos aminoácidos cisterna entre los cuales se forma un puente disulfuro para ciclar dicha subunldad. Preferentemente estas cisternas provienen de una sustitución serina-cisteína.

En una realización más preferida de este aspecto de la invención el fragmento de la filagrina a partir del cual se obtiene la subunidad b, es el comprendido entre las posiciones 36 y 324 de dicha proteína, y en una realización todavía más preferida la secuencia comprendida entre las posiciones 36 y 324 de la filagrina es la SEQ ID NO:7.

En una realización aun más preferida la subunidad (b) tiene la secuencia SEQ ID NO:1 (cfclcyc).

En una realización más preferida de este aspecto de la invención el fragmento de fibrina a partir del cual se obtiene la subunidad a, es el comprendido entre las posiciones 617 y 631 de la a-fibrina, o bien el comprendido entre las posiciones 43 y 62 de la (3-fibrina. En una realización preferente la secuencia comprendida entre las posiciones 617 y 631 de la a-fibrina es la SEQ ID NO:8. En una realización también preferente la secuencia comprendida entre las posiciones 43-62 de la (3-fibrina es la SEQ ID NO:9.

En una realización todavía más preferida de este aspecto de la invención la subunidad (a) del polipéptido quimérico tiene la secuencia se seleccionada del grupo:

a. SEQ ID NO:2(p18),

b. SEQ ID NO:3(p19), ó

c. SEQ ID NO:4 (p22),

En una realización todavía más preferida de este aspecto de la Invención la subunidad (a) del polipéptido quimérico tiene la secuencia SEQ ID NO:5 (p38).

En otra realización preferida de la invención el polipéptido quimérico tiene la SEQ ID NO:6 (p18-cfc1cyc).

En una realización también preferida de la invención el polipéptido quimérico, según cualquiera de los aspectos anteriores de la Invención, está marcado o conjugado con moléculas transportadoras.

En adelante estos pollpéptldos quiméricos citrulinados serán denominados como "polipéptido quimérico de la invención". Dichos péptldos podrán ser obtenidos por procedimientos sobradamente conocidos en el estado de la técnica, tales como la síntesis química de péptidos en fase sólida (ver material y métodos).

Un segundo aspecto de la Invención se relaciona con péptldos citrulinados de las cadenas a y (3 de la fibrina donde dichos péptldos tienen cualquiera de las secuencias seleccionadas del grupo: p18, p19, p22 y p38 o secuencias análogas (péptldos análogos), donde dichos péptidos citrulinados y péptidos análogos son capaces de interaccionar con los auto... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido quimérico, que comprende al menos dos subunidades peptídicas citrulinadas (a) y (b), unidas covalentemente, que tiene sustituido al menos una arginina de cada subunidad peptídica por citrulina, donde:

a. la subunidad (a) tiene al menos un 85% de homología con un fragmento citrulinado de al menos 7 amlno ácidos:

I. del fragmento SEQ ID NO: 8 que va de la posición 617 a 631 de la proteína a-fibrina, y donde al menos la arginina ha sido sustituida por citrulina en la posición 63, o ¡i. del fragmento SEQ ID NO: 9 que va de la posición 43 a 62 de la proteína (3-fibrina, y

b. la segunda subunidad (b) está ciclada entre al menos dos aminoácidos cisterna formando un puente disulfuro, y tiene al menos un 85% de homología con un fragmento citrulinado de al menos 7 aminoácidos de la proteina filagrina,

donde dicho polipéptido quimérico es capaz de interacclonar con anticuerpos autolnmunes generados durante la

artritis reumatolde.

2. Polipéptido quimérico según la reivindicación 1, donde la subunldad (b) se obtiene del fragmento SEQ ID NO: 7 que va de la posición 36 a 324 de la proteína filagrina.

3. Polipéptido quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2 donde la subunldad (b) comprende la secuencia SEQ ID NO: 1.

4. Polipéptido quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde la subunidad (a) comprende una secuencia seleccionada entre:

a. SEQ ID NO:2 ,

b. SEQ ID NO:3,

c. SEQ ID NO:4, o

d. SEQ ID NO:5.

5. Polipéptido quimérico según la reivindicación 4, donde la subunidad (a) está ciclada entre al menos dos aminoácidos cisterna formando un puente disulfuro.

6. Polipéptido quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el polipéptido quimérico es SEQ ID NO: 6.

7. Composición que comprende un polipéptido quimérico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Método para la detección de auto-anticuerpos específicos de la artritis reumatoide en una muestra biológica que comprende:

a. Poner en contacto la muestra biológica con al menos uno de los polipéptidos quiméricos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 ó la composición de la reivindicación 7, y

b. Detectar la interacción entre los auto-anticuerpos específicos y los polipéptidos quiméricos o la composición del paso (a).

9. Kit de diagnóstico o pronóstico de la artritis reumatoide que comprende al menos uno de los polipéptidos quiméricos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o la composición de la reivindicación 7, y los reactivos y/o tampones necesarios para permitir la formación del complejo anticuerpo-antígeno.