Partículas funcionales similares al virus de la gripe (VPL).

Una partícula similar a un virus (VLP) que comprende una proteína M1 del virus de la gripe,

una proteína hemaglutinina (HA) de la gripe y una proteína neuraminidasa (NA) de la gripe, en que la secuencia de aminoácidos de dicha proteína M1 es idéntica al menos en el 98 % a la SEC ID Nº 49 y en donde la VLP se expresa en una célula de insecto.

Partículas funcionales similares al virus de la gripe (VPL)

Antecedentes de la invención El virus de la gripe es un miembro de la familia Orthomyxoviridae (para una revisión, véase Murphy y Webster, 1996) . Hay tres subtipos de virus de gripe que se han designado A, B, y C. El virión de la gripe contiene un genoma ARN segmentado en sentido negativo. El virión de la gripe incluye las siguientes proteínas: hemaglutinina (HA) , neuraminidasa (NA) , matriz (M1) , proteína del canal ion protón (M2) , nucleoproteína (NP) , proteína 1 básica polimerasa (PB1) , proteína 2 básica polimerasa (PB2) , proteína ácida polimerasa (PA) , y proteína 2 no estructural (NS2) . Las HA, NA, M1 y M2 están asociadas a la membrana, mientras que NP, PB1, PB2, PA, y NS2 son proteínas asociadas a la nucleocápside. La NS1 es la única proteína no estructural que no se asocia con partículas de virión sino que es específica de las células infectadas con gripe. La proteína M1 es la proteína más abundante en las partículas de gripe. Las proteínas HA y NA son glucoproteínas de la envoltura, responsables de la unión y penetración de las partículas víricas en la células, y fuentes de los epítopos inmunodominantes principales para la neutralización vírica y la inmunidad protectora. Tanto las proteínas HA como NA se consideran los componentes más importantes para las vacunas profilácticas de gripe.

La infección por virus de la gripe se inicia por la unión de la proteína HA de la superficie del virión a un receptor celular que contiene ácido siálico (glucoproteínas y glucolípidos) . La proteína NA interviene en el proceso del receptor de ácido siálico, y la penetración del virus en la célula depende de la endocitosis mediada por receptor dependiente de HA. En los confines ácidos de los endosomas internalizados que contienen un virión de gripe, la proteína HA se somete a cambios conformacionales que dan lugar a la fusión de las membranas de la células huésped y vírica seguidos por la pérdida de recubrimiento y la liberación mediada por M2 de las proteínas M1 de las ribonucleoproteínas asociadas con la nucleocápside (RNP) , que migra en el núcleo de la célula para la síntesis vírica. Los anticuerpos contra la molécula HA evita la infección vírica neutralizando la infectividad del virus, mientras que los anticuerpos contra las proteínas NA producen su efecto en las etapas tempranas de la replicación vírica.

Las vacunas de virus de gripe A y B tienen licencia actualmente como vacunas trivalentes para administración parenteral. Estas vacunas trivalentes se producen como volumen monovalente en la cavidad alantoidea de embriones de pollo, se purifican por tasa de centrifugación zonal o cromatografía en columna, se inactivan con formalina o β-propiolactona, y se formulan como una mezcla de las dos cepas de tipo A y la cepa de tipo B de los virus de gripe en circulación entre la población humana en un año determinado. Las vacunas comerciales 35 disponibles de gripe son vacunas víricas de virus entero (WV) o subviriones (SV; antígeno de superficie fraccionado o purificado) . La vacuna de WV contiene viriones intactos, inactivados. Las vacunas SV que se tratan con disolventes tales como tri-n-butil-fosfato (Flu-Shield, Wyeth-Lederle) contienen casi todas las proteínas víricas estructurales y algunas de las envolturas víricas. Las vacunas SV solubilizadas con Triton X-100 (Fluzone, Sanofi-Aventis; Fluvirin, Novartis) contienen principalmente agregados de monómeros HA, NA, y NP, aunque están presentes cantidades residuales de otras proteínas víricas estructurales. Recientemente se concedió la aprobación de comercialización de una vacuna vírica atenuada adaptada al frío por la FDA para su uso comercial como una vacuna de suministro intranasal indicada para la inmunización activa y la prevención de la enfermedad producida por los virus de gripe A y B en niños sanos y adolescentes, de 5-17 años de edad y adultos sanos de 18-49 años de edad.

Se han desarrollado varios productos recombinantes como candidatos de vacunas de gripe recombinantes. Estas estrategias se dirigen a la expresión, producción y purificación de proteínas HA y NA de virus gripe tipo A, incluyendo la expresión de estas proteínas utilizando células de insecto infectadas por baculovirus (Crawford et al, 1999; Johansson, 1999; Treanor et al., 1996) , vectores víricos (Pushko et al., 1997; Berglund et al., 1999) , y construcciones de vacuna ADN (Olsen et al., 1997) .

Crawford et al. (1999) han demostrado que la HA de gripe expresada en células de insecto infectadas con baculovirus es capaz de evitar la enfermedad de gripe letal causada por los subtipos de gripe aviar H5 y H7. Al mismo tiempo, otro grupo ha demostrado que las proteínas HA y NA de gripe expresada por baculovirus inducen 55 respuestas inmunitarias superiores en animales que las inducidas por una vacuna convencional (Johansson et al., 1999) .La inmunogenicidad y eficacia de la hemaglutinina del virus de gripe equina que se expresa por baculovirus se comparó con un candidato de vacuna ADN homóloga (Olsen et al., 1997) . En conjunto, los datos demostraban que se puede inducir un alto grado de protección contra la exposición al virus de gripe con proteínas HA y NA recombinantes, utilizando varias estrategias experimentales y en diferentes modelos animales.

Lakey et al. (1996) demostraron que una vacuna de HA de virus de gripe derivada de baculovirus era bien tolerada e inmunogénica en voluntarios humanos en un estudio de seguridad de dosis escalada en Fase I. Sin embargo, los resultados de los estudios en Fase II realizados en varios sitios clínicos en voluntarios vacunados con varias dosis de vacunas de gripe que comprendían proteínas HA y/o NA indicaban que las vacunas de subunidades proteicas 65 recombinantes no producían una inmunidad protectora [G. Smith, Protein Sciences; M. Perdue, USDA, Personal Communications]. Estos resultados indicaban que los epítopos conformacionales presentados en la superficie de

peplómeros HA y NA de viriones infecciosos eran importantes en la producción de anticuerpos neutralizantes e inmunidad protectora.

Con respecto a la inclusión de otras proteínas del virus de la gripe en los candidatos de vacunas recombinantes de gripe, se llevaron a cabo varios estudios, incluyendo los experimentos que implicaban la nucleoproteína del virus de la gripe, NP, sola o en combinación con proteína M1 (Ulmer et al., 1993; Ulmer et al., 1998; Zhou et al., 1995; Tsui et al., 1998) . Estos candidatos de vacunas, que estaba compuestos de proteínas internas de virión casi invariables, producían una inmunidad de amplio espectro que era primariamente celular (tanto células T CD4+ como CD8+ de memoria) Estos experimentos implicaban el uso de los vectores genéticos víricos o ADN. Se necesitaban cantidades relativamente grandes de ADN inyectado, ya que los resultados de los experimentos con dosis bajas de ADN indicaban poca o ninguna protección (Chen et al., 1998) . Además, se pueden necesitar más investigaciones preclínicas y clínicas para evaluar si tales estrategias basadas en ADN que implican la NP y M1 de la gripe son seguras, eficaces, y persistentes.

Recientemente, en un intento para desarrollar vacunas más eficaces para la gripe, se utilizaron proteínas particuladas como vehículos de epítopos de proteína M2. El razonamiento para el desarrollo de una vacuna basada en M2 era que en estudios animales la inmunidad protectora contra la gripe se producía por proteínas M2 (Slepushkin et al., 1995) . Neir y nck et al. (1999) utilizaron un dominio transmembrana de 23 aa como pareja de fusión aminoterminal con el antígeno central del virus de la hepatitis B (HBcAg) para exponer el epítopo M2 en la superficie de partículas tipo cápside de HBcAg. Sin embargo, a pesar del hecho de que tanto la proteína M2 de longitud completa como VLP M2-HBcAg inducían anticuerpos detectables y protección en ratones, era improbable que se basaran vacunas de gripe en el futuro basadas exclusivamente en la proteína M2, ya que la proteína M2 estaba presente en un bajo número de copias por virión, era débilmente antigénica, era incapaz de producir anticuerpos que se unieran a los viriones de gripe libres, y era incapaz de bloquear la unión del virus a los receptores celulares (es decir, neutralización del virus) .

Aunque la investigación previa ha demostrado que las glucoproteínas de superficie del virus de gripe, HA y NA, son las primeras dianas para la producción de inmunidad protectora contra el virus de la gripe y que M1 proporciona una diana conservada par inmunidad células contra la gripe, un nuevo candidato puede incluir estos antígenos víricos como una partícula proteica macromolecular, tal como partículas... [Seguir leyendo]

1. Una partícula similar a un virus (VLP) que comprende una proteína M1 del virus de la gripe, una proteína hemaglutinina (HA) de la gripe y una proteína neuraminidasa (NA) de la gripe, en que la secuencia de aminoácidos de dicha proteína M1 es idéntica al menos en el 98 % a la SEC ID Nº 49 y en donde la VLP se expresa en una célula de insecto.

2. La VLP de la reivindicación 1, en la que dicha proteína M1 comprende la SEC ID Nº 49.

3. La VLP de la reivindicación 1, en la que dicha HA y NA son H5 y N1, respectivamente.

4. La VLP de la reivindicación 3, en la que dicha H5 o N1 son de un clado 1 del virus de la gripe H5N1, o en la que dichas H5 y N1 son de un clado 2 del virus de la gripe H5N1.

5. La VLP de la reivindicación 4, en la que a) dichas proteínas H5 y N1 comprenden las SEC ID Nos 53 y 55, respectivamente, o una secuencia que comprende al menos una identidad de secuencia del 90 % con dichas secuencias, o b) dichas proteínas H5 y N1 comprenden las SEC ID Nos 43 y 47, respectivamente, o una secuencia que comprende una identidad de secuencia de al menos el 90 % con dichas secuencias.

6. La VLP de la reivindicación 3, en la que dichas H5 y N1 son de un virus de la gripe que se ha aislado de un animal infectado.

7. La VLP de la reivindicación 6, en la que dicho animal infectado es un ser humano.

8. La VLP de la reivindicación 1, en la que dicha célula de insecto es Sf9.

9. La VLP de la reivindicación 1, en la que dicha VLP provoca anticuerpos neutralizantes en un ser humano o un animal que son protectores contra la infección de gripe cuando se administra a dichos ser humano o animal.

10. Una composición inmunogénica que comprende una dosis eficaz de una VLP de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

11. La composición de la reivindicación 10, en la que dicha composición comprende un adyuvante.

12. Una vacuna que comprende una dosis eficaz de una VLP de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9.

13. La vacuna de la reivindicación 12, en la que dicha vacuna comprende al menos dos VLP diferentes con diferentes proteínas de la gripe.

14. La vacuna de las reivindicaciones 12 o 13, en la que dicha vacuna comprende un adyuvante.

15. Una vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en la que dicha vacuna se ha tratado para inactivar baculovirus.

16. La vacuna de la reivindicación 15, en la que dicho tratamiento de inactivación comprende la incubación de una muestra que comprende VLP en aproximadamente un 0, 2 % de β-propil lactona (BPL) durante aproximadamente 3 horas a aproximadamente 25 ºC.

17. La composición inmunogénica o la vacuna de las reivindicaciones 11 o 14 en que la dicho adyuvante comprende Novasomes®.

18. El uso de una VLP de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9 para la preparación de una vacuna para un animal, en donde la vacuna induce inmunidad sustancial contra la infección por el virus de la gripe en dicho animal.

19. Una vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 12-17 para su uso en un método de tratamiento en donde la vacuna induce inmunidad sustancial contra la infección por el virus de la gripe en un animal.

20. La vacuna para el uso de la reivindicación 19 o el uso de la reivindicación 18, en donde la vacuna se administra al animal por vía oral, intradérmica, intranasal, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea.

21. Un método de elaboración de una VLP de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, que comprende la expresión de una proteína MI, una proteína hemaglutinina (HA) de la gripe y una proteína neuraminidasa (NA) de la gripe en una célula de insecto en donde la secuencia de aminoácidos de dicha proteína MI es idéntica al menos en un98% a la SEC ID Nº 49.

22. El método de la reivindicación 21, en el que dicha célula de insecto es Sf9.