Partículas funcionales similares al virus (VLP) de la gripe.

Una composición para su uso como vacuna, dicha composición comprendiendo:

i. una partícula similar a virus (VLP) que comprende proteínas estructurales de la gripe, donde las proteínas estructurales de la gripe de dicha VLP consisten en M1, HA y NA, donde la VLP se autoensambla en una célula hospedadora de una construcción recombinante; y

ii. un vehículo o diluyente.

Partículas funcionales similares al virus (VLP) de la gripe.

Antecedentes de la invención [0001] El virus de la gripe es un miembro de la familia Orthomyxoviridae (para una revisión, véase Murphy y Webster, 1996) . Existen tres subtipos de virus de la gripe denominados A, B y C. El virión de la gripe contiene un genoma de ARN fragmentado, de sentido negativo. El virión de la gripe incluye las siguientes proteínas: hemaglutinina (HA) , neuraminidasa (NA) , proteína de matriz (M1) , canal iónico que permite el paso de protones (M2) , nucleoproteína (NP) , proteína básica de la polimerasa 1 (PB1) , proteína básica de la polimerasa 2 (PB2) , proteína ácida de la polimerasa (PA) y proteína no estructural 2 (NS2) . Las proteínas HA, NA, M1 y M2 están asociadas a la membrana, mientras que las proteínas NP, PB1, PB2, PA y NS2 son proteínas asociadas a la nucleocápside. La NS1 es la única proteína no estructural no asociada a las partículas de virión, sino que es específica de las células infectadas por el virus de la gripe. La proteína M1 es la proteína más abundante en las partículas de virus de la gripe. Las proteínas HA y NA son glucoproteínas de la envoltura y son las responsables de la unión del virus y de la penetración de las partículas víricas en la célula y son la fuente de los principales epítopos inmunodominantes para la neutralización del virus y la inmunidad protectora. Ambas proteínas, la HA y la NA, se consideran los componentes más importantes de las vacunas antigripales profilácticas.

La infección por el virus de la gripe se inicia con la fijación de la proteína de superficie HA del virión a un receptor celular que contiene ácido siálico (glucoproteínas y glucolípidos) . La proteína NA media el procesamiento del receptor de ácido siálico y la penetración del virus en la célula depende de la endocitosis mediada por el receptor dependiente de HA. En los confines ácidos de los endosomas internalizados que contiene un virión de la gripe, la proteína HA2 sufre una serie de cambios conformacionales que provocan la fusión de las membranas viral y celular y la degradación de la cápside del virus y la liberación mediada por M2 de las proteínas M1 de las ribonucleoproteínas (RNP) asociadas a la nucleocápside, que migran hacia el núcleo celular para la síntesis de ARN viral. Los anticuerpos anti-proteínas HA impiden la infección por el virus neutralizando la infectividad del virus, mientras que los anticuerpos anti-proteínas NA actúan sobre las etapas iniciales de la replicación viral.

Las vacunas contra el virus de la gripe A y B inactivadas están aprobadas actualmente para administración parenteral. Estas vacunas trivalentes se producen en la cavidad alantoidea de huevos de pollo embrionados, se purifican por centrifugación diferencial o cromatografía en columna, se inactivan con formalina o β-propiolactona y se formulan como una mezcla de las dos cepas de la cepa de tipo A y tipo B de los virus de la gripe en circulación entre la población humana durante un año dado. Las vacunas antigripales disponibles en el mercado son vacunas víricas constituidas por el virus completo (WV) o el subvirión (SV; vacunas de virus fraccionados o con el antígeno de superficie purificado) . La vacuna WV contiene viriones intactos inactivados. Las vacunas SV tratadas con disolventes, tales como tri-n-butilfosfato (Flu-Shield, Wyeth-Lederle) contienen casi todas las proteínas estructurales virales y algunas de la envuelta viral. Las vacunas SV solubilizadas con Triton X-100 (Fluzone, Connaught; Fluvirin, Evans) contienen agregados de monómeros de HA, NA y NP principalmente, aunque también hay cantidades residuales de otras proteínas estructurales virales. Una potencial vacuna con virus de la gripe vivos atenuados adaptados al frío (FluMist, MedImmune) ha obtenido recientemente la autorización de comercialización por la FDA para su uso comercial como vacuna de administración intranasal indicada para la inmunización activa y la prevención de la enfermedad causada por los virus de la gripe A y B en niños sanos y adolescentes de 5 a 17 años de edad y adultos sanos de 18 a 49 años de edad.

Se han desarrollado varios productos recombinantes como candidatos a vacuna antigripal recombinante. Estas estrategias se han centrado en la expresión, producción y purificación de las proteínas HA y NA del virus de la gripe de tipo A, incluida la expresión de estas proteínas utilizando células de insecto infectadas por baculovirus (Crawford et al, 1999; Johansson, 1999; Treanor et al., 1996) , vectores virales (Pushko et al., 1997; Berglund et al, 1999) y construcciones de vacunas de ADN (Olsen et al., 1997) .

Crawford et al. (1999) demostraron que la HA del virus de la gripe expresada en células de insecto infectadas con baculovirus es capaz de prevenir la gripe letal causada por los subtipos del virus de la gripe aviar H5 y H7. Al mismo tiempo, otro grupo demostró que las proteínas HA y NA del virus de la gripe expresadas en baculovirus inducían respuestas inmunitarias en animales superiores a las inducidas por una vacuna convencional (Johansson et al., 1999) . Se comparó la inmunogenicidad y la eficacia de la hemaglutinina del virus de la gripe equina expresada en baculovirus con las de un candidato a vacuna de ADN homóloga (Olsen et al., 1997) . En conjunto, los datos demostraron que con las proteínas HA o NA recombinantes se puede conseguir un alto grado de protección frente a la exposición al virus de la gripe, utilizando diversos métodos experimentales y en diferentes modelos en animales.

Lakey et al. (1996) demostraron que una vacuna que contiene la proteína HA del virus de la gripe derivada de baculovirus se toleraba bien y era inmunogénica en voluntarios humanos en un estudio de Fase I de seguridad del aumento de la dosis. Sin embargo, los resultados de los estudios de Fase II realizados en diversos centros en voluntarios humanos vacunados con diferentes dosis de vacunas de la gripe que contenían proteínas HA y/o NA, indicaban que las vacunas con la proteína subunidad recombinante no provocaban inmunidad protectora [G. Smith, Protein Sciences; M.

Perdue, USDA, Comunicaciones personales]. Estos resultados indicaban que los epítopos conformacionales presentados en la superficie de los peplómeros de HA y NA de viriones infecciosos eran importantes para provocar la formación de anticuerpos neutralizantes y el desarrollo de inmunidad protectora.

En cuanto a la inclusión de otras proteínas del virus de la gripe en candidatos a vacunas antigripales recombinantes, se han llevado a cabo varios estudios, como los experimentos con la nucleoproteína del virus de la gripe, NP, sola o en combinación con la proteína M1 (Ulmer et al., 1993; Ulmer et al., 1998; Zhou et al., 1995; Tsui et al., 1998) . Estos candidatos a vacunas, que estaban compuestos por proteínas internas del virión apenas modificadas, provocaban una inmunidad de amplio espectro que era principalmente celular (linfocitos T de memoria tanto CD4+ como CD8+) . Estos experimentos implicaban el uso de los vectores genéticos de ADN o virales. Se necesitaron cantidades relativamente elevadas de ADN inyectado, ya que los resultados de los experimentos con dosis más bajas de ADN indicaban bajos niveles o ausencia de protección (Chen et al., 1998) . Por lo tanto, puede ser necesario realizar más estudios preclínicos y clínicos para evaluar si dichas estrategias basadas en el ADN que implicaban la NP y la M1 del virus de la gripe son seguras, eficaces y persistentes.

Recientemente, en un intento por desarrollar vacunas antigripales más eficaces, se han utilizando partículas de proteínas como vehículos de los epítopos de la proteína M2 del virus de la gripe. El desarrollo de una vacuna basada en M2 estaba justificado porque en estudios en animales, las proteínas M2 provocaban inmunidad protectora frente al virus de la gripe (Slepushkin et al., 1995) . Neir y nck et al. (1999) utilizaron un dominio transmembrana M2 de 23 aa de longitud como pareja de fusión amino terminal con el antígeno del núcleo del virus de la hepatitis B (HBcAg) para exponer el epítopo (s) de M2 de la superficie de las partículas pseudocápside del HbcAg. Sin embargo, a pesar del hecho de que tanto la proteína M2 de longitud completa como la VLP M2-HBcAg inducían anticuerpos detectables y protección en ratones, era improbable que las futuras vacunas antigripales se basaran exclusivamente en la proteína M2, ya que la proteína M2 estaba presente en un número bajo de copias por virión, mostraba una antigenicidad débil, era incapaz de provocar la formación de anticuerpos capaces de unirse a viriones de la gripe libres y era incapaz de bloquear la unión del virus a los receptores de la célula (es decir,... [Seguir leyendo]

1. Una composición para su uso como vacuna, dicha composición comprendiendo:

i. una partícula similar a virus (VLP) que comprende proteínas estructurales de la gripe, donde las proteínas estructurales de la gripe de dicha VLP consisten en M1, HA y NA, donde la VLP se autoensambla en una célula hospedadora de una construcción recombinante; y

ii. un vehículo o diluyente.

2. La composición para uso su según la reivindicación 1 que es una vacuna multivalente.

3. La composición para uso su según la reivindicación 1, en la que la célula hospedadora es una célula eucariota.

4. La composición para uso su según la reivindicación 3, en la que la célula eucariota es una célula de insecto.

5. La composición para uso su según la reivindicación 1, en la que la construcción recombinante es una construcción de baculovirus recombinante.

6. La composición para uso su según la reivindicación 1, en la que al menos una de dichas M1, H1 y NA es de origen aviar o mamífero

7. La composición para uso su según la reivindicación 1, en la que dicha M1 es de origen aviar.

8. La composición para uso su según la reivindicación 1, en la que al menos una de dichas M1, H1 y NA deriva del grupo que consiste en los virus de la gripe de subtipo A y B.

9. La composición para uso su según la reivindicación 1, que además comprende un adjuvante.

10. La composición para uso su según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha estructura exhibe actividad hemaglutinina.

11. La composición para uso su según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha estructura exhibe actividad neuraminidasa.

12. La composición para uso su según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha estructura comprende epítopos conformacionales de gripe VLP que inducen anticuerpos neutralizantes de virus.

Fracción Nº* Título

1 < 1:500

3 < 1:500

5 1:500

7 1:1000

9 1:2000

11 1:2000

12 1:4000

14 1:500

16 < 1:500

PBS** < 1:500

A/Shangdong/9/93*** 1:1000

* Fracciones del gradiente de sacaros.

2. 60%

** Control negativo *** Control positivo TABLA 1 Figura 13

Virus Cepa Gen RT-PCR Cebador

Tipo A (H3N2) Sydney/5/97 Hemaglutinina (HA) DirectaInversa Neuraminidasa (NA) DirectaInversa Matriz (M1) DirectaInversa M2 DirectaInversa Nucleoproteína (NP) DirectaInversa Tipo B Harbin Hemaglutinina (HA) DirectaInversa Neuraminidasa (NA) Directa

Inversa TABLA 2 Figura 14

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido.

Documentos de patentes citados en la descripción Literatura diferente de patentes citadas en la descripción