VLPS quiméricas de la gripe aviar.

Un método para aumentar la eficiencia de la producción de partículas similares al virus de la gripe (VLP) en una célula hospedadora,

que comprende expresar en una célula hospedadora una proteína de la matriz de la gripe aviar (M1) y las proteínas hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) de la gripe estacional humana,

en el que la proteína M1 de la gripe aviar es una proteína M1 de la gripe A/Indonesia/5/05, y

en el que dicho aumento de la eficiencia de la producción de VLP es con relación a una célula hospedadora que expresa dichas proteínas HA y NA con una proteína M1 de la gripe estacional.

VLPS quiméricas de la gripe aviar

Antecedentes de la invención

El virus de la gripe es un miembro de la familia Ortomixoviridae (para una revisión, véase Murphy y Webster, 1996) . Hay tres subtipos de virus de la gripe designados A, B y C. El virión de la gripe contiene un genoma de ARN de sentido negativo segmentado. El virión de la gripe incluye las siguientes proteínas: las proteínas hemaglutinina (HA) , neuraminidasa (NA) , de la matriz (Ml) , proteína de los canales iónicos de protones (M2) , nucleoproteína (NP) , proteína básica de la polimerasa 1 (PBL) , proteína básica de la polimerasa 2 (PB2) , proteína ácida de la polimerasa (PA) y la proteína no estructural 2 (NS2) . Las HA, NA, Ml y M2 están asociadas a la membrana, mientras que NP, PBL, PB2, PA y NS2 son proteínas asociadas a la nucleocápside. El NS1 es la única proteína no estructural no asociada con partículas de virión pero específica de las células infectadas con la gripe. La proteína M1 es la proteína más abundante en partículas de la gripe. Las proteínas HA y NA son glicoproteínas de la cubierta, responsables de la fijación del virus y la penetración de las partículas virales en la célula, y las fuentes de los principales epítopos inmunodominantes para la neutralización del virus y la inmunidad protectora. Las proteínas HA y NA se consideran los componentes más importantes para vacunas profilácticas contra la gripe debido a que son altamente inmunogénicas.

Hasta la fecha, todas las vacunas contra la gripe disponibles comercialmente para las cepas no pandémicas en Estados Unidos se han propagado en huevos de gallina embrionados. Aunque el virus de la gripe crece bien en los huevos de gallina, la producción de la vacuna depende de la disponibilidad de huevos. Los suministros de huevos deben organizarse y las cepas para la producción de vacunas deben seleccionarse antes de la próxima temporada de gripe, lo que limita la flexibilidad de este enfoque, y a menudo da lugar a retrasos y escasez en la producción y la distribución. Desafortunadamente, algunas cepas de la vacuna de la gripe no se replican bien en huevos embrionados de pollo y tienen que asilarse mediante cultivo celular en un procedimiento costoso y que consume tiempo.

Los sistemas para la producción de virus de la gripe en cultivo celular también se han desarrollado en los últimos años (véase, por ejemplo, Furminger. Vaccine Production, en Nicholson et al. (eds) Textbook of Influenza pp. 324 332; Merten et al. (1996) Production of influenza virus in cell cultures for vaccine preparation, en Cohen & Shafferman (eds) Novel Strategies in Design and Production of Vaccines pp. 141 -151) . Normalmente, estos métodos implican la infección de células hospedadoras inmortalizadas adecuadas con una cepa seleccionada de virus. Aunque se eliminan muchas de las dificultades relacionadas con la producción de vacunas en huevos de gallina, no todas las cepas patógenas de la gripe crecen bien y se pueden producir de acuerdo con métodos de cultivo tisular establecidos. Además, muchas cepas con características deseables, por ejemplo, atenuación, sensibilidad a la temperatura y adaptación fría, adecuadas para la producción de vacunas vivas atenuadas, no se han cultivado con éxito en cultivos de tejidos utilizando métodos establecidos. Además, los virus atenuados vivos no han sido aceptados por el público en general debido a los temores de reversión a un virus virulento.

Las partículas similares a virus imitan la estructura general de una partícula de virus sin necesidad de contener material infeccioso. Las VLP carecen de genoma viral de ADN o ARN, pero conservan la estructura tridimensional de un virus auténtico. Las VLP tienen la capacidad de estimular respuestas mediadas por células B, respuestas 45 proliferativas de células CD4 y respuestas de linfocitos T citotóxicos (véase, Schirmbeck et al. (1996) Eur. J. Immunol. 26:2812 -2822) . Además, las partículas similares a virus inducen respuestas de células T restringidas al MHC de clase I.

Sumario de la invención

La presente invención comprende un método para aumentar la eficiencia de la producción de VLP de la gripe que comprende expresar una M1 de la gripe aviar y las proteínas HA y NA de la gripe estacional en una célula hospedadora. La proteína M1 de la gripe aviar es una proteína M1 de la gripe A/Indonesia/5/05. Dicha HA o NA pueden tener actividad hemaglutinina y neuraminidasa, respectivamente.

La presente solicitud también describe una VLP quimérica que comprende una proteína M1 de la gripe aviar y al menos una proteína de la gripe no aviar. En una realización, dicha proteína de la gripe aviar no es HA y/o NA de un virus de la gripe no aviar. En otra realización, dicha proteína de la gripe no aviar no es una proteína de la gripe estacional. En otra realización, dicho HA o NA tiene actividad hemaglutinina o neuraminidasa, respectivamente. En otra realización, dichas HA y/o NA son proteínas quiméricas. En otra realización, las proteínas quiméricas comprenden secuencias de dominios externos de las proteínas HA y/o NA de la gripe no aviar fusionadas a los dominios terminales transmembrana y/o citoplásmicos de las HA y/o NA de la gripe aviar o heterólogos. En otra realización, dicha proteína de la gripe no aviar procede de un agente infeccioso.

La presente solicitud también describe una formulación antigénica que comprende una VLP quimérica que comprende una proteína M1 de la gripe aviar y al menos una proteína de la gripe no aviar. En una realización, dicha

VLP comprende HA y/o NA de un virus de la gripe no aviar. En otra realización, dicha HA o NA tienen actividad hemaglutinina o neuraminidasa, respectivamente. En otra realización, dichas HA y/o NA son proteínas quiméricas.

La presente solicitud también describe vacunas que comprenden una VLP quimérica que comprende una proteína M1 de la gripe aviar y al menos una proteína de la gripe no aviar. En una realización, dicha VLP comprende HA y/o NA de un virus de la gripe no aviar. En otra realización, dicha HA o NA tienen actividad hemaglutinina o neuraminidasa, respectivamente. En otra realización, dichas HA y/o NA son proteínas quiméricas.

La presente solicitud también describe un método para inducir inmunidad en un vertebrado que comprende la administración a dicho vertebrado de una VLP quimérica que comprende una proteína M1 de la gripe aviar y al menos una proteína de la gripe no aviar. En una realización, dicha respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria humoral. En una realización, dicha respuesta inmunitaria es una respuesta inmunitaria celular.

La presente solicitud también describe un método para prevenir y/o reducir una infección viral o síntoma de la misma 15 que comprende la administración a un vertebrado de una VLP quimérica que comprende una proteína M1 de la gripe aviar y al menos una proteína de la gripe no aviar.

La presente solicitud también comprende un método de reducción de la gravedad de la gripe en una población, que comprende administrar la una VLP quimérica que comprende una proteína M1 de la gripe aviar y al menos una 20 proteína de la gripe no aviar a suficientes individuos en dicha población con el fin de prevenir o disminuir la posibilidad de transmisión del virus de la gripe a otro individuo en dicha población.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa un gel SDS-PAGE teñido derivado de VLP hechas de diferentes construcciones después del aislamiento a partir de un gradiente de sacarosa. La Figura 2 representa una transferencia de tipo Western teñida derivado de VLP hechas de diferentes construcciones después del aislamiento a partir de un gradiente de sacarosa. La Figura 3 es un gel SDS-PAGE teñido derivado de VLP hechas de HA y NA de tipo salvaje o híbridos de A /

Indonesia /5/05 M1 y A / Fujian / 411/2002. La Figura 4 representa una transferencia de tipo Western teñida derivada de VLP hechas de HA y NA de tipo salvaje o híbridos de A / Indonesia / 5/05 M1 y A / Fujian / 411/2002. La Figura 5 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína SARS S con el dominio transmembrana y carboxiterminal de la HA de H5N1 de Indonesia (subrayado) .

La Figura 6 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína M1 Indonesia H5N1. La Figura 7 representa el vector pFastBac 1 que contiene secuencias para SARS S con el dominio TM/CT de la HA de H5N1 y la proteína M1 de H5N1 de Indonesia. La Figura 8 representa las VLP quiméricas de SARS S/Indo M1 purificadas. La calle 1 es la tinción con azul de Coomassie. La calle 2 es la transferencia de tipo western, panel superior: anti SARS S; panel inferior: anti M1 de la gripe. La Figura 9 representa... [Seguir leyendo]

1. Un método para aumentar la eficiencia de la producción de partículas similares al virus de la gripe (VLP) en una célula hospedadora, que comprende expresar en una célula hospedadora una proteína de la matriz de la gripe aviar (M1) y las proteínas hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) de la gripe estacional humana, en el que la proteína M1 de la gripe aviar es una proteína M1 de la gripe A/Indonesia/5/05, y en el que dicho aumento de la eficiencia de la producción de VLP es con relación a una célula hospedadora que expresa dichas proteínas HA y NA con una proteína M1 de la gripe estacional.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la proteína HA de la gripe tiene actividad hemaglutinina.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la proteína NA de la gripe tiene actividad neuraminidasa.

4. El método de la reivindicación 1, en el que la célula hospedadora se selecciona del grupo que consiste en: una 15 célula de levadura, una célula de insecto, una célula de anfibio, una célula aviar y una célula de mamífero.

5. El método de la reivindicación 4, en el que la célula hospedadora es una célula de insecto seleccionada del grupo que consiste en: una célula Sf9, una célula Sf21 y una célula de Trichoplusia ni.

6. El método de la reivindicación 5, en el que la célula de insecto es una célula Sf9.