Mutantes de alfa-amilasa.

Variante de una α-amilasa original tipo Termamyl, donde la α

-amilasa original tipo Termamyl es seleccionada entre:

(i) SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID 5 Nº: 6, SEC ID Nº: 7 o SEC ID Nº: 8; o

(ii) una α-amilasa original tipo Termamyl que tiene al menos el 80% de homología con una de las secuencias de (i); y

donde la variante tiene actividad α-amilasa y comprende las mutaciones H183* y G184* y una sustitución seleccionada de N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, V (con respecto a SEC ID Nº: 6) o en posiciones correspondientes en otra α-amilasa original tipo Termamyl, y

donde la variante muestra termoestabilidad aumentada a pH ácido y/o a concentración de Ca2+ por debajo de 40 ppm, en comparación con una variante correspondiente que comprende las mutaciones H183* y G184* sin la sustitución en N195.

Mutantes de alfa-amilasa Campo de la invención

[0001] La presente invención está relacionada, entre otras cosas, con las variantes nuevas (mutantes) de a-amilasas originales tipo Termamyl, sobre todo variantes que presentan termoestabilidad aumentada a pH ácido y/o a bajas concentraciones de Ca2+ (con respecto a la original) que es ventajoso con respecto a las aplicaciones de las variantes en el tratamiento industrial del almidón particularmente (p. ej. licuefacción o sacarificación del almidón).

Antecedentes de la invención

[0002] Las a-amilasas (a-1,4-glucan-4-glucanohidrolasas, EC 3,2,1,1) constituyen un grupo de enzimas que catalizan la hidrólisis del almidón y otros oligo y polisacáridos 1,4-glucosídicos lineales y ramificados.

[0003] Hay un cuerpo muy extenso de patentes y de bibliografía científica acerca de esta clase de enzimas muy importante industrialmente. Varias a-amilasas tales como variantes de a-amilasas tipo Termamyl son conocidas a partir de p. ej. WO 90/11352, WO 95/10603, WO 95/26397, WO 96/23873 y WO 96/23874.

[0004] Entre las descripciones más recientes referentes a las a-amilasas, WO 96/23874 proporciona datos estructurales tridimensionales en cristales de rayos X para una a-amilasa tipo Termamyl que consiste en 300 residuos de aminoácidos N-terminales de la a-amilasa de B. amyloliquefaciens y los aminoácidos 301-483 del extremo C-terminal de la a-amilasa de B. licheniformis que comprende la secuencia de aminoácidos (estando disponible comercialmente bajo el nombre comercial Termamyl), y que está así cercanamente relacionada con las a-amilasas de Bacillus industrialmente importantes (que en el contexto presente están incluidas dentro del significado del término " a-amilasas tipo Termamyl", y que incluyen, entre otras cosas, las a-amilasas de B. licheniformis, B. amyloliquefaciens y B. stearothermophiius). La WO 96/23874 también describe la metodología para diseñar, basándose en un análisis de la estructura de una a-amilasa original tipo Termamyl, variantes de la a-amilasa original tipo Termamyl que presentan propiedades alteradas con respecto a la original.

[0005] La WO 95/35382 (Gist Brocades B.V.) se refiere a enzimas amilolíticas derivadas de B. licheniformis con propiedades mejoradas que permiten la reducción de la concentración de Ca2+ bajo la aplicación sin una pérdida de rendimiento de la enzima. La enzima amilolítica comprende uno o más cambios de aminoácidos en las posiciones seleccionadas del grupo de 104, 128, 187, 188 de la secuencia de a-amilasa de B. licheniformis.

[0006] La WO 96/23873 (Novo Nordisk) expone variantes de a-amilasa tipo Termamyl que tienen termoestabilidad aumentada obtenida por la deleción de pares en la región R181 *, G182*, T183* y G184* de la secuencia mostrada en SEC ID N°: 1 de la misma.

Descripción breve de la invención

[0007] La presente invención se refiere a nuevas variantes (mutantes) a-amilolíticas de una a-amilasa tipo Termamyl, en particular variantes que presentan termoestabilidad aumentada (con respecto a la original) que es ventajosa en relación con el tratamiento industrial del almidón (licuefacción, sacarificación del almidón y similares).

[0008] Más específicamente, la presente invención ofrece una variante de una a-amilasa tipo Termamyl original como se define en la reivindicación 1.

[0009] La presente invención proviene del sorprendente descubrimiento de los inventores de que en caso de combinar dos mutaciones (se describirá más abajo), la termoestabilidad de las a-amilasas tipo Termamyl es aumentada a pH ácido y/o a baja concentración de Ca2+ en comparación con mutaciones únicas, tal como la mutación descrita en la WO 96/23873 (Novo Nordisk), es decir, eliminación de pares en la región R181 *, G182*, T183* y G184* de la secuencia mostrada en la SEC ID N°: 1 de la presente.

[0010] La invención se refiere adicionalmente a constructos de ADN que codifican variantes de la invención, a la composición que comprende variantes de la invención, a métodos para preparar variantes de la invención, y al uso de las variantes y composiciones de la invención, solas o en combinación con otras enzimas a-amilolíticas, en varios procesos industriales, p. ej., licuefacción de almidón.

Breve descripción del dibujo

[0011] La figura 1 es un alineamiento de las secuencias de aminoácidos de seis a-amilasas originales tipo Termamyl en el contexto de la invención. Los números en el extremo izquierdo designan las secuencias de aminoácidos respectivas como sigue:

1: SEC ID N°: 2,

2: Kaoamyl,

3: SEC ID N°: 1,

4: SEC ID N°: 5,

5: SEC ID N°: 4,

6: SEC ID N°: 3.

Descripción detallada de la invención La a-amilasa tipo Termamyl

[0012] Es bien sabido que varias a-amilasas producidas por Bacillus spp. son altamente homologas a nivel aminoácido. Por ejemplo, la a-amilasa de B. licheniformis que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N°: 4 (comercialmente disponible como Termamyl) se ha descubierto que es aproximadamente un 89% homologa a la a- amilasa de B. amiloliquefaciens que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N°: 5 y aproximadamente un 79% homologa a la a-amilasa de B. stearothermophilus que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N°: 3. a-amilasas homologas adicionales incluyen una a-amilasa derivada de una cepa NCIB 12289, NCIB 12512, NCIB 12513 o DSM 9375 de Bacillus sp., todas las cuales están descritas con detalle en WO 95/26397, y la a-amilasa descrita por Tsukamoto et al., Biochemical and Biophysical Research Communications, 151 (1988), págs. 25-31.

[0013] Otras a-amilasas homologas adicionales incluyen la a-amilasa producida por la cepa de B. licheniformis descrita en EP 0252666 (ATCC 27811), y las a-amllasas identificadas en la WO 91/00353 y la WO 94/18314. Otras a-amilasas de B. licheniformis comerciales tipo Termamyl son Optitherm y Takatherm (disponible de Solvay), Maxamyl (disponible de Gist-Brocades/Genencor), Spezym AA y Spezyme Delta AA (disponible de Genencor), y Keistase (disponible de Daiwa).

[0014] Por la homología sustancial descubierta entre estas a-amilasas, éstas se consideran que pertenecen a la misma clase de a-amilasas, es decir la clase de "a-amllasas tipo Termamyl".

[0015] Por consiguiente, en el contexto presente, el término "a-amilasa tipo Termamyl" se destina a Indicar una a- amilasa que, a nivel aminoácido, muestra una homología sustancial a Termamyl, es decir, la a-amilasa de B. licheniformis que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N°: 4 de la presente. En otras palabras, una a-amilasa tipo termamyl es una a-amilasa que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en las SEC ID Nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 en la presente, y la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N°: 1 de WO 95/26397 (la misma que la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N°: 7 aquí) o en la SEC ID N°: 2 de WO 95/26397 (la misma que la secuencia de aminoácidos mostrada como la SEC ID N°: 8 aquí) o en Tsukamoto et al., 1988, (que la secuencia de aminoácidos está mostrada en la SEC ID N°: 6 aquí) o i) que muestra al menos un 80%, especialmente al menos un 85%, especialmente preferido al menos un 90%, incluso especialmente más preferido al menos un 95% de homología con al menos una de dichas secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC IDN°1 o2o3o4o5o6o 7 u 8.

[0016] Opcionalmente, la a-amllasa tipo Termamyl puede además i) mostrar reactividad cruzada ¡nmunológica con un anticuerpo producido contra al menos una de dichas a-amilasas, y/o ii) ser codificada por una secuencia de ADN que hibridiza a las secuencias de ADN que codifican las a-amilasas especificadas anteriormente que se desprenden de las SEC ID N°: 9, 10, 11 o 12 de la presente solicitud (cuyas secuencias codificantes codifican las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEC ID N°: 1, 2, 3, 4 y 5 de la presente, respectivamente) a partir de la SEC ID N°: 4 de la WO 95/26397 (cuya secuencia de AND, junto con el codón de parada TAA, se muestra en la SEC ID N°: 13 de la presente y codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEC ID N°: 8 de la presente) y de SEC ID N°: 5 de la WO 95/26397 (mostrada en la SEC ID N°: 14 de la presente), respectivamente.

[0017] La "homología" puede ser determinada usando cualquier algoritmo convencional, preferiblemente usando el programa GAP del paquete GCG versión 7.3 (Junio 1993) usando valores por defecto para penalizaciones de espado, que es una penalización por creación de espacio de 3.0 y penalización por extensión de espacio de 0.1, (Genetic Computer Group (1991) Programme Manual for the GCG Package, versión 7, 575 Science... [Seguir leyendo]

1. Variante de una a-amilasa original tipo Termamyl, donde la a-amilasa original tipo Termamyl es seleccionada entre:

(i) SEC ID N°: 1, SEC ID N°: 2, SEC ID N°: 3, SEC ID N°: 4, SEC ID NO: 5, SEC ID N°: 6, SEC ID N°: 7 o SEC ID N°: 8; o

(¡I) una a-amllasa original tipo Termamyl que tiene al menos el 80% de homología con una de las secuencias de (i);

y

donde la variante tiene actividad a-amllasa y comprende las mutaciones H183* y G184* y una sustitución seleccionada de N195A, R, D, C, E, Q, G, H, I, L, K, M, P, S, T, W, Y, V (con respecto a SEC ID N°: 6) o en posiciones correspondientes en otra a-amilasa original tipo Termamyl, y

donde la variante muestra termoestabilidad aumentada a pH ácido y/o a concentración de Ca2+ por debajo de 40 ppm, en comparación con una variante correspondiente que comprende las mutaciones H183* y G184* sin la sustitución en N195.

2. Constructo de ADN que comprende una secuencia de ADN que codifica una variante de a-amilasa según la reivindicación 1.

3. Vector de expresión recombinante que porta un constructo de ADN según la reivindicación 2.

4. Célula que es transformada con un constructo de ADN según la reivindicación 2 o un vector según la reivindicación 3.

5. Célula según la reivindicación 4, que es un microorganismo.

6. Aditivo de detergente que comprende una variante de a-amilasa según la reivindicación 1, opcionalmente en forma de granulado no pulverulento, líquido estabilizado o enzima protegida.

7. Composición de detergente que comprende una variante de a-amilasa según la reivindicación 1.

8. Composición de detergente para lavar la vajilla a mano o a máquina que comprende una variante de a-amilasa según la reivindicación 1.

9. Composición de detergente para lavar la ropa que comprende una variante de a-amilasa según la reivindicación 1.

10. Composición que comprende:

(i) una mezcla de a-amilasas de B. licheniformis que tiene la secuencia mostrada en SEC ID N°: 4 con una o más variantes según la reivindicación 1 derivadas a partir de (como la a-amilasa original tipo Termamyl) la a-amilasa de B. stearothermophilus que tiene la secuencia mostrada en SEC ID N°: 3; o

(ii) una mezcla de a-amilasas de B. stearothermophilus que tiene la secuencia mostrada en SEC ID N°: 4 con una o más variantes según la reivindicación 1 derivadas a partir de una o más a-amilasas originales tipo Termamyl; o

(iii) una mezcla de una o más variantes según la reivindicación 1 derivadas a partir de (como la a-amilasa original tipo Termamyl) la a-amilasa de B. stearothermophilus que tiene la secuencia mostrada en SEC ID N°: 3 con una o más variantes según la reivindicación 1 derivadas a partir de una o más otras a-amilasas originales tipo Termamyl.

11. Uso de una variante de a-amilasa según la reivindicación 1 o una composición según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 para lavar la ropa y/o la vajilla.

12. Uso de una variante de a-amilasa según la reivindicación 1 o una composición según la reivindicación 9 para desencolado textil.

13 Uso de una variante de a-amilasa según la reivindicación 1 o una composición según la reivindicación 10 para licuefacción del almidón.