Moléculas de ácido nucleico y procedimientos para identificar moduladores de la actividad de GPR84.

Una molécula de ácido nucleico aislado que codifica las proteínas CD36, Gqi9, y receptor 84 acoplado a proteína G (GPR84).

Moléculas de ácido nucleico y procedimientos para identificar moduladores de la actividad de GPR84

Antecedentes de la invención La señalización del gusto se encuentra en todo el reino animal, desde simples metazoos hasta el más complejo de los vertebrados. Se cree que el sentido del gusto está mediado por receptores, es decir, receptores metabotrópicos o inotrópicos. Las células que expresan receptores del gusto, cuando se exponen a ciertos estímulos químicos, suscitan el sentido del gusto mediante despolarización para generar un potencial de acción, que desencadena el sentido. Por tanto, los receptores del gusto reconocen específicamente moléculas que provocan un sentido específico del gusto. Estas moléculas también se conocen en el presente documento como "estimulantes del gusto". Muchos receptores del gusto pertenecen a la superfamilia de receptores de 7 dominios transmembrana (Hoon, y col. (1999) Cell96:451; Adler, y col. (2000) Cell100:693) , que también se conocen como receptores acoplados a proteína G (GPCR) . Se cree que otros sabores están mediados por proteínas de canal.

El análisis bioquímico y la clonación molecular de varios de estos receptores ha revelado los principios básicos referentes a la función de estos receptores. Por ejemplo, la patente de EE.UU. n.º 5.691.188 describe el modo en que tras la unión de un ligando a un GPCR, el receptor supuestamente experimenta un cambio conformacional que conduce a la activación de la proteína G. Las proteínas G están compuestas por tres subunidades: una subunidad de unión a nucleótido guanilo, una subunidad ß, y una subunidad . Cuando está unido GDP, la proteína G existe como un heterotrímero, el complejo Gß. Cuando está unido GTP, la subunidad se disocia del heterotrímero, dejando un complejo Gß. Cuando un complejo Gß se asocia de forma funcional con un receptor acoplado a proteína G activado en una membrana celular, se aumenta la tasa de intercambio de GTP por GDP unido y aumenta la tasa de disociación de la subunidad G unida del complejo Gß. La subunidad G libre y el complejo Gß por tanto son capaces de transmitir una señal a elementos corriente abajo de una diversidad de vías de transducción de señales. Estos eventos forman la base para una multiplicidad de diferentes fenómenos de señalización celular, incluyendo, por ejemplo, los fenómenos de señalización que se identifican como percepciones sensoriales neurológicas tales como el gusto y/o el olfato.

Se cree que los mamíferos tienen cinco modalidades básicas de gusto, dulce, amargo, ácido, salado, y umami (el sabor del glutamato monosódico) . Véase, por ejemplo, Kinnamon, y col. (1992) Ann. Rev. Physiol. 54:715-31; Lindemann (1996) Physiol. Rev. 76:718-66; Stewart, y col. (1997) Am. J Physiol. 272:1-26. Numerosos estudios fisiológicos en animales han demostrado que las células receptoras del gusto pueden responder selectivamente a diferentes estímulos químicos. Véase, por ejemplo, Akabas, y col. (1988) Science 242:1047-50; Gilbertson, y col. (1992) J. Gen. Physiol. 100:803-24; Bernhardt, y col. (1996) J. Physiol. 490:325-36; Cummings, y col. (1996) J. Neurophysiol. 75:1256-63.

Se sabe mucho acerca de la psicofísica y fisiología de la función celular del gusto. Por tanto, la identificación y aislamiento de nuevos receptores del gusto y moléculas de señalización del gusto podría permitir nuevos métodos de modulación química y genética de vías de transducción del gusto. Por ejemplo, la disponibilidad de moléculas receptoras y de canal permite la exploración de agonistas, antagonistas, agonistas inversos, y moduladores de alta afinidad de la actividad del gusto. Dichos compuestos moduladores del gusto podrían ser útiles en las industrias farmacéutica y alimentaria para mejorar el sabor de una diversidad de productos para el consumidor, o para bloquear sabores indeseables, por ejemplo, en ciertos agentes farmacéuticos.

Se conocen secuencias completas o parciales de diversos receptores quimiosensoriales humanos y de otros eucariotas. Véase, por ejemplo, Pilpel y Lancet (1999) Protein Science 8:969-977; Mombaerts (1999) Annu. Rev. Neurosci. 22:487-50; Wang, y col. (2006) J. Biol. Chem. M608019200. Véase también, la patente de EE.UU. n.º 5.874.243, el documento WO 92/17585, el documento WO 95/18140, el documento WO 97/17444, el documento WO 99/67282, y el documento WO 2007/027661. Además, se ha realizado la identificación de ligandos para receptores acoplados a proteína G tales como GPR84. Véase Wang, y col. (2006) supra; el documento WO 2007/027661; y la solicitud de patente de EE.UU. n.º 2007/0196867. Matsumara y col. (2007. Biomedical Research, 28, pág.49-55) describe la expresión de GPR en la papila gustativa de rata respecto a la percepción de ácido graso.

Sumario de la invención De acuerdo con un primer aspecto de la invención se proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que codifica las proteínas CD36, Gqi9, y receptor 84 acoplado a proteína G (GPCR84) . La presente invención también abarca vectores de expresión con expresión inducible o constitutiva de CD36, Gqi9, y GPR84.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención se proporciona una célula huésped recombinante aislada transformada con un vector de expresión de la invención y que co-expresa las proteínas CD36, Gqi9, y GPR84.

También se divulga un procedimiento para identificar un modulador de la actividad de GPR84. El procedimiento implica poner en contacto una célula huésped recombinante, que co-expresa las proteínas CD36, Gqi9, y GPCR84, con un compuesto de ensayo y determinar el efecto funcional del compuesto de ensayo sobre la actividad de GPR84 identificando de ese modo un modulador de GPR84.

Descripción detallada de la invención Se describen en el presente documento moléculas de ácido nucleico que codifican el receptor 84 acoplado a proteína G (GPR84) , CD36 y Gqi9, y el uso de las mismas en la identificación de ligandos para GPR84, por ejemplo, agonistas y antagonistas. GPR84 puede ser un receptor del gusto de grasas y puede usarse en ensayo de exploración para compuestos que imiten el sabor a grasa.

Como se usa en el presente documento, el término "aislado", cuando se refiere a una molécula de ácido nucleico se refiere a un estado de purificación o concentración diferente del que existe de forma natural. Las moléculas de ácido nucleico descritas en el presente documento pueden aislarse o asociarse de otro modo con estructuras o compuestos a los que no están normalmente asociadas en la naturaleza, de acuerdo con una diversidad de procedimientos y procesos conocidos para los especialistas en la técnica.

GPR84 se ha identificado como un receptor para ácidos grasos libres de cadena media (Wang, y col. (2006) supra) . La proteína GPR84 se encuentra en una diversidad de especies incluyendo el ser humano, ratón, rata, y similares y pueden usarse moléculas de ácido nucleico que codifican una cualquiera de estas proteínas de acuerdo con la presente invención. A este respecto, la presente invención abarca moléculas de ácido nucleico que codifican proteínas GPR84 enumeradas en la Tabla 1.

TABLA 1

Fuente N.º de acceso a GENBANK de secuencia de aminoácidos SEC ID N.º N.º de acceso a GENBANK de secuencia de ácido nucleico SEC ID N.º % de identidad*

Homo sapiens NP_065103 1 NM_020370 2 100 %

Mus musculus NP_109645 3 NM_030720 4 85, 4 %

Rattus norvegicus NP_001102979 5 NM_001109509 6 83, 8 %

Bos taurus NP_001033657 7 NM_001038568 8 89, 6 %

*% de identidad basado en la alineación con la proteína GPR84 humana.

En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico codifica una proteína GPR84 humana. En otras realizaciones, la molécula de ácido nucleico codifica una proteína GPR84 human de la SEC ID N.º 1. En realizaciones particulares, la molécula de ácido nucleico que codifica la proteína GRP84 humana se expone en la SEC ID N.º 9.

Funcionalmente, las proteínas GPR84 divulgadas en el presente documento son miembros de una familia de receptores relacionados acoplados a proteína G de siete dominios transmembrana, que se cree que están implicados en la transducción del gusto. Estructuralmente, las secuencias de nucleótidos de los miembros de la familia de GPR84 pueden codificar proteínas relacionadas que incluyen un dominio extracelular, siete dominios transmembrana, y un dominio citoplasmático. Los miembros relacionados de la familia de GPR84 de otras especies comparten al menos aproximadamente el 60 %, 70 %, 80 %, o 90 % de identidad de secuencia proteica sobre una región de al menos aproximadamente 50 restos de aminoácido de longitud, opcionalmente 100, 200, 300, o más restos de aminoácido de longitud... [Seguir leyendo]

1. Una molécula de ácido nucleico aislado que codifica las proteínas CD36, Gqi9, y receptor 84 acoplado a proteína G (GPR84) .

2. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 1.

3. El vector de expresión de la reivindicación 2, en el que la expresión de CD36, Gqi9, y GPR84 es inducible.

4. El vector de expresión de la reivindicación 2, en el que la expresión de CD36, Gqi9, y GPR84 es constitutiva.

5. Una célula huésped aislada transformada con el vector de expresión de acuerdo con la reivindicación 2 y que coexpresa las proteínas CD36, Gqi9, y GPR84.